Diese Forschung erhielten keine spezifischen Einräumung von Fördereinrichtungen in den öffentlichen, kommerziellen oder Non-Profit-Sektor.

Alle Experimente stimmten mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss von Daiichi Sankyo Co., Ltd.
1. die Probenvorbereitung
<ol><li>Sammeln Sie Blut (mindestens 0,5 mL) der femoralen Ader Cynomolgus Affen in 2K-haltigen EDTA-Röhrchen. Hinweis: Die Citrat und Heparin sind nicht akzeptabel, weil diese Antikoagulanzien anschließende PCR14,15hemmen.</li>
	<li>Legen Sie die gesammelten Proben sofort auf Eis und Verfahren zur Isolierung von Plasma innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g bei 4 ° C für 5 min.</li>
	<li>Übertragen des Überstands in ein 2 mL Reaktionscup, gefolgt von Zentrifugation bei 16.000 x g bei 4 ° C für 5 min Zellenrückstand und restliche Thrombozyten zu entfernen. Hinweis: Quantifizierung der MiRNAs kann Thrombozyten Kontamination16deutlich betroffen.</li>
	<li>200 µL-Aliquots des Überstands in frischen 2 mL Mikroröhrchen und bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren. Hinweis: Ein bestimmtes Volumen von jeder Probe wird für die RNA-Extraktion verwendet; Daher muss das Volumen der aliquoten genau zu sein.</li>
</ol>2. RNA-Extraktion
<ol><li>Auftauen von eingefrorenen Proben auf Eis (aus Schritt 1.5).<ol>
<li>Halten Sie Probe kalt auf dem Eis während der RNA-Extraktion. Chill-Lyse-Reagenz und chloroform auf Eis vor dem Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 Bände (1000 µL) Lyse-Reagenz, mit monophasischen Lösung von Phenol und Guanidin erfolgt, um die Probe (200 µL) und mischen Sie kräftig durch Vortexen für 1 min.</li>
	<li>Fügen Sie 5 µL 5 nM synthetischen Caenorhabditis Elegans MiRNA (Syn-Cel-MiR-238-3 p).</li>
	<li>Fügen Sie 1 Volumen (200 µL) von Chloroform und mischen Sie kräftig durch Vortexen für 1 min.</li>
	<li>Halten Sie für 2 bis 3 min auf Eis, und dann Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g bei 4 ° C für 15 min.</li>
	<li>Übertragen Sie die wässrige Phase sorgfältig auf eine neue Reaktionscup. Hinweis: Übertragen Sie die organische Phase (rot) oder Interphase (weiß) nicht. Das Volumen der wässrigen Phase gesammelt sein um zu vermeiden, Umgang mit Inkonsistenz, die erhöhte technische Variation führt einheitlich. Die übliche Höhe der wässrigen Phase, die in diesem Protokoll übertragen wurde 650 µL.</li>
	<li>Fügen Sie 1,5 Mengen (975 µL) Ethanol, und mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe in einer entsprechenden Spalte und Adapter, gefolgt von Vakuumtrocknung für 3 min mit Vakuum Mannigfaltigkeiten. Wenn das Probenvolumen mehr als 700 µL ist, wiederholen Sie diesen Schritt, um die restliche Lösung verarbeiten. Hinweis: Spaltenbasierten RNA Isolierung ist kompatibel mit Vakuum und Zentrifugation Methode.</li>
	<li>Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 1 min fügen Sie 200 µL Ethanol hinzu.</li>
	<li>Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 2 min fügen Sie 800 µL RWT Puffer hinzu.</li>
	<li>Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 2 min fügen Sie 800 µL RPE Puffer hinzu.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.11.</li>
	<li>Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 1 min fügen Sie 300 µL Ethanol hinzu.</li>
	<li>Setzen Sie die Säule auf eine neue Reaktionscup, und bei 12.000 x g bei Raumtemperatur (15-25 ° C) für 1 min zentrifugieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Spalte an eine neue Reaktionscup zu, und fügen Sie 50 µL Nuklease-freies Wasser.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur (15-25 ° C) für 3 min und Zentrifuge bei 8.000 × g bei Raumtemperatur (15-25 ° C) für 1 min stehen.</li>
	<li>Wenden Sie das Eluat erneut in die Spalte.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.16 und speichern Sie Eluat bei-80 ° C bis zu seiner Verwendung zu.</li>
</ol>(3) cDNA Synthese
<ol><li>Auftauen von eingefrorenen Proben (aus Schritt 2.18).</li>
	<li>
Bereiten Sie bekannten Konzentration der synthetische RNA-Oligonukleotide, die MiRNAs Ziel entsprechen.
	<ol>
<li>Verwenden Sie synthetische RNA-Oligonukleotid zur Erzeugung einer Standardkurve in qPCR. Stammlösung 1 x 108 Kopie/µL Konzentration ist für Speicherzwecke vorbereitet.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Stammlösung 10-fach um 1 x 107 Kopie/µL (nicht vorverstärkt Proben) oder 1 x 105 Kopie/µL (vorverstärkt Proben) funktionierende Lösung als die höchste Konzentration für die Erstellung der Standardkurve zu erhalten. Im Allgemeinen ist eine empfohlene Intervall für die Konzentrationen der Standardkurve 1 x 107 bis 1 x 102 Kopie/µL (nicht vorverstärkt Proben) oder 1 x 105 bis 1 x 100 Kopie/µL (vorverstärkt Proben).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie multiplex RT Primer Pool durch Mischen gleiche Volumina von 20 X RT Primer für Ziel MiRNAs. Hinweis: Wie in Abbildung 2gezeigt, ein Schwimmbad mit bis zu 4 Ziel MiRNAs erfolgen durch das Mischen von 20 X RT Primer aller MiRNAs im Pool. Als eines der Ziel-MiRNAs in jedem Röhrchen beizufügen Cel-MiR-238 (Fremdüberwachung). Fügen Sie bei weniger als 4 Ziel MiRNAs gleiche Volumina von 1/10-TE-Puffer statt 20 X RT Primer hinzu.</li>
	<li>RT Reaktion Mischung vorbereiten: 3 µL RT-Grundierung (aus Schritt 3.3), Schwimmbad, 0,15 µL 100 mM dNTPs mit dTTP, 1 µL Reverse Transkriptase (50 U/µL), 1,5 µL 10 x RT Puffer, 0,19 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL) und 4.16 µL Nuklease-freies Wasser.</li>
	<li>Mischung 10 µL RT Reaktion durch Pipettieren mit 5 µL RNA-Probe (aus Schritt 3.1) oder Oligonukleotide (aus Schritt 3.2) mischen und inkubieren Sie für 5 min auf Eis.</li>
	<li>Reversen Transkription auf einem Thermocycler Apparat laufen: 16 ° C für 30 min, 42 ° C für 30 min, gefolgt von einer endgültigen Reverse Transkriptase Inaktivierung Schritt bei 85 ° C für 5 min. Store reverse Transkription Proben bei-80 ° C bis zur Verwendung.</li>
</ol>(4) Vorverstärker (Optional)
Hinweis: Die MiRNAs, die Cq-Werte über 35 oder mehr im nachfolgenden qPCR zeigen sind vorverstärkt.
<ol><li>Auftauen von eingefrorenen Proben (aus Schritt 3,6).</li>
	<li>10-divisibel serielle Verdünnungen von RT Produkt aus synthetischen RNA-Oligonukleotide zu machen; 1 x 105 bis 1 x 100 Kopie/µL für die Erstellung der Standardkurve.</li>
	<li>Bereiten Sie Multiplex-Assays Grundierung Pool durch Mischen gleichen Volumina (5 µL) 20 x Assay Primer für Ziel MiRNAs mit die Endkonzentration jedes Assay-Grundierung, 200-fach verdünnt von TE-Puffer in einem Endvolumen von 1.000 µL. Hinweis: Die Assay-Primer, deren Ziel MiRNAs in nachfolgenden qPCR ohne Vorverstärkung und die Cel-MiR-238 (Fremdüberwachung) nachweisbar sein kann, nicht Grundierung Pool gehören.</li>
	<li>Vorverstärkung Reaktion Mischung vorbereiten: 12,5 µL 2 x Ready-to-Use sorgt Reagenz, 3,75 µL Assays Grundierung Pool (vom Schritt 4.3) und 6,25 µL Nuklease-freies Wasser.</li>
	<li>Mix-22,5 µL Vorverstärkung Reaktion durch Pipettieren mit 2,5 µL reverse Transkription Musters (aus Schritt 4.1) oder Oligonukleotide (aus Schritt 4.2) mischen und inkubieren Sie für 5 min auf Eis.</li>
	<li>Reaktion auf einem Thermocycler Apparat laufen: 95 ° C für 10 min; gefolgt von 12 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 4 min. vorverstärkt Proben bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
</ol>5. Quantitative Real-Time PCR (qPCR)
<ol><li>Auftauen von eingefrorenen Proben (von 3,6 oder Schritt 4.6).</li>
	<li>Verdünnen Sie die Proben 5-Fach mit sterilem Wasser.</li>
	<li>Bereiten Sie 10-divisibel serielle Verdünnungen von der RT Produkt aus synthetischen RNA-Oligonukleotide vor; 1 x 107 bis 1 x 102 Kopie/µL (nicht vorverstärkt Proben) oder 1 x 105 bis 1 x 100 Kopie/µL (vorverstärkt Proben) zur Erzeugung von Standardkurven.</li>
	<li>QPCR Reaktion Mischung vorbereiten: 10 µL 2 x Ready-to-Use Verstärkung Reagenz, 1 µL 20 x Assay Reagenz, mit vor-/Rücklauf PCR Primer und Sonde entsprechend Ziel MiRNA und 7 µL Nuklease-freies Wasser.</li>
	<li>Übertragen Sie 18 µL von qPCR Reaktion Mischung auf die schnelle optische Reaktion der 96-Well-Platten, und fügen Sie 2 µL der verdünnten Proben (von 5.2 oder 5.3 Schritt) in die Vertiefungen. Hinweis: Proben und Standards für qPCR sind Duplikate gegründet.</li>
	<li>Die Dichtplatte mit Klebefolie und Zentrifugieren Sie kurz.</li>
	<li>Reaktion auf eine Echtzeit-Thermocycler laufen: 95 ° C für 20 s, gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 1 s bis 60 ° C für 20 s.</li>
</ol>(6) Datenanalyse
<ol><li>Berechnen Sie die rohen Kopienzahl jeder Probe mit Datenanalyse-Software, die mit entsprechenden Echtzeit-Thermocycler arbeitet. Hinweis: Schwelle Linie manuell auf "1.0" in alle Platten in der Studie soll die Reproduzierbarkeit im Vergleich zu ihren Cq Täler zu bestätigen. Abkürzungniveau befindet sich im Cq > 40 Zyklen.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert der rohen Kopienzahl jeder Probe von Duplikaten.</li>
	<li>Berechnen Sie Korrekturfaktor, indem eine Kopienzahl der Cel-MiR-238 in jeder Probe durch den Durchschnitt der Kopienzahl des Cel-MiR-238 aus allen Proben in einem entsprechenden Rohr. Hinweis: Wie in Abbildung 2dargestellt, enthält jedes Rohr bis zu 4 Ziel MiRNAs einschließlich Cel-MiR-238 (Fremdüberwachung). Daher wird Korrekturfaktor für jedes Rohr mit entsprechenden Cel-MiR-238-Wert berechnet.</li>
	<li>Berechnen Sie die angepasste Kopie Anzahl dividiert die gemittelten roh Kopienzahl jeder Probe (ab Schritt 6.2) durch den Korrekturfaktor (aus Schritt 6.3) für jede Probe.</li>
	<li>Die absolute Kopienzahl durch Multiplikation der Anzahl der eingestellten raw Kopie jeder einzelnen Probe (ab Schritt 6.4) zu berechnen, indem die den Verdünnungsfaktor für jede Probe. Hinweis: Der Verdünnungsfaktor ist "5" in diesem Protokoll Schritt 5.2 abgeleitet ist.</li>
	<li>Berechnen Sie die Effizienz der PCR Verstärkung von der Neigung des Grundstücks die Cq-Werte für jede serielle Verdünnung gegen Log cDNA Konzentration. Hinweis: Formel für die Berechnung der Effizienz; E = (10(-1/Neigung) -1) x 100 %.</li>
	<li>Berechnen Sie die technische Variante mit den Cq-Werten von Cel-MiR-238 aus allen Proben mit Hilfe der Formel E = (2 X Verstärkung Wirksamkeit)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Hinweis: Schritte, 6.5 und 6.7 dienen zur Qualitätsbewertung des Verfahrens.</li>
</ol>

<ol>
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Der Autor hat keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Unsere umfassende Bewertung zur Verfügung gestellt einer strengeren statistischen Analysis des Ausmaßes der Dynamikumfang, die eindeutig darauf hingewiesen, dass das Ausmaß der Unterschiede zwischen den einzelnen Proben sehr unterschiedlich die MiRNAs getestet wurde. Obwohl diese Variationen auf ihre Kleinmengen in Körperflüssigkeiten zurückzuführen sein können, sollte angemerkt werden, dass diese Daten nicht nur biologische Variationen, sondern auch technische Unterschiede widerspiegeln. Die meisten der technisc...

Eine wachsende Zahl von Studien wurden Mikro-RNAs (MiRNAs) als Biomarker für die Diagnose und Prognose von Krebserkrankungen zu erforschen oder Überwachung und Erkennung von anderen Krankheiten in präklinischen und klinischen Studien1,2,3 . Quantitative Real-Time reverse Transkription PCR (RT-qPCR) ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden verwendet, um einzelne Ziel MiRNAs, bewerten, weil diese Technik empfindlicher ist als Microarray4 und RNA Sequenzierung Plattformen5basierend. Im Allgemeinen ist MiRNA Ausdruck im Vergleich zu einer Referenzprobe mit der ΔCq Methode6gemessen. Diese Methode eignet sich für die Untersuchung von physiologischer Veränderungen im gen Ausdruck Zielwerte. Allerdings hat relative Quantifizierung der zirkulierenden MiRNAs Dienstprogramm wegen ihrer geringen Mengen begrenzt. Darüber hinaus macht technische Variation es schwierig, die Ergebnisse aus verschiedenen Studien zu vergleichen, da verschiedene Labors der RT-qPCR experimentelle Protokolle unterschiedlich anpassen, was führt zum inkonsistenten oder sogar widersprüchlich ergibt sich aus verschiedene Studien7.
Angesichts der oben genannten Bedenken möglicherweise absolute Quantifizierung besser geeignet für die Beurteilung von kleinen Mengen von MiRNAs in Körperflüssigkeiten. Die absolute Quantifizierungsmethode verwendet eine Standardkurve generiert aus bekannten Konzentrationen von synthetische RNA-Oligonukleotide, die nacheinander auf die entsprechenden Ziel-MiRNA-8identisch sind. Gesundheit und Environmental Sciences Institute (HESI) Fachausschuss Genomics kürzlich durchgeführten umfassendere Studien um absolute Messergebnisse von Plasma MiRNAs Test standortübergreifend zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass vergleichbare Ergebnisse mit einem Standardprotokoll für die absolute Quantifizierung von MiRNAs über mehrere Test Seiten9erbracht werden. Die RT-qPCR-Assay-Methode in der vorliegenden Studie beschriebenen ist fast identisch mit der HESI Standardprotokoll, inklusive Multiplex Analyse mehrerer MiRNA Ziele und Vorverstärkung, die Erkennung von geringe Expression MiRNAs unterstützen.
In dieser Studie ein bestimmtes Volumen (200 µL) von EDTA-Plasma vorbereitet aus dem Blut gesammelt von der femoral Ader des bewussten Cynomolgus Affen (n = 50) verwendeten10war. Das folgende Protokoll beschreibt das Verfahren für die Herstellung von Plasma-Proben, Gewinnung von MiRNA und RT-qPCR, einschließlich Vorverstärkung. Noch wichtiger ist, wurde weitere technische Informationen über das Protokoll aufgenommen, so dass die Menge der Ziel-MiRNAs in den Proben in Kombination mit einem gut ausgebildeten Prozess überprüft werden kann. Zunächst wurde die Standardkurve jede MiRNA für seine individuelle Erfassungsbereich, vor seiner Quantifizierung in biologischen Proben überprüft. Zweitens war die Qualität der gegenwärtigen Methode mittels Cq-Werte für eine externe Steuerung (Cel-MiR-238) umfassend bewertet. Daher ergibt sich diese Plattform informativere und zuverlässige Daten für den Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen Studien oder Laboratorien.
Die Profile der 8 MiRNAs wurden in diesem Bericht als repräsentative Ergebnisse aus der Assay-Methode, die hier beschrieben. Diese MiRNAs sind vorgeschlagen worden, wie mögliche Sicherheit Biomarker Gewebeschädigung der Leber (MiR-122 und MiR-192), Herz (MiR-1, MiR-208a, MiR 208b und MiR-499a) und Skelettmuskulatur (MiR-133a und MiR-206) in Nagetieren und Menschen3zugeordnet, 11,12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:216px;">BD Microtainer tube (K2EDTA)</td>
			<td style="width:195px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">365974</td>
			<td style="width:167px;">For blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030124359</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&#160; 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&#160; 2.0 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Synthetic oligonucleotide</td>
			<td style="width:195px;">Hokkaido System Science</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Individual miRNA (0.2 &#956;mol,HPLC grade)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-EDTA Buffer&#160; (pH 8.0)</td>
			<td style="width:195px;">Nippon Gene</td>
			<td style="width:119px;">314-90021</td>
			<td style="width:167px;">TE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Buffer RPE</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Buffer RWT</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">217004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nuclease-Free Water&#160;</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">129114</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic&#160;</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">219600</td>
			<td style="width:167px;">ID:MSY0000293, 5 nmol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SC Adapters</td>
			<td style="width:195px;">TAIGEN Bioscience Corporation</td>
			<td style="width:119px;">S0120</td>
			<td style="width:167px;">For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">VacEZor 36 Complete System</td>
			<td style="width:195px;">TAIGEN Bioscience Corporation</td>
			<td style="width:119px;">M3610</td>
			<td style="width:167px;">For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4351405</td>
			<td style="width:167px;">Fast 96-Well Block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">9700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4346907</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4311971</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4444557</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000248</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002245</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002246</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002222</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000491</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000511</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002290</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 001352</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Reverse 
			Transcription Kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4366597</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan PreAmp Master Mix (2&#215;)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4391128</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Wako Pure Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">035-02616</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol (99.5)</td>
			<td style="width:195px;">Wako Pure Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">057-00456</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of plasma microrna levels in cynomolgus monkeys, using quantitative real-time reverse transcription pcr

RT-qPCR ist eine der häufigsten Methoden, um einzelne Ziel MiRNAs bewerten. MiRNAs sind in der Regel im Vergleich zu einer Referenzprobe gemessen. Diese Methode eignet sich für die Prüfung von physiologischer Veränderungen im gen Ausdruck Zielwerte. Absolute Quantifizierung mit besseren statistischer Analyse ist jedoch für eine umfassende Bewertung der gen-Expression-Ebenen vorzuziehen. Absolute Quantifizierung ist noch nicht gebräuchlich. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Messung der absoluten Werte der Plasma MiRNA, mit RT-qPCR, mit oder ohne Vorverstärkung.
Ein bestimmtes Volumen (200 µL) von EDTA-Plasma wurde aus dem Blut gesammelt von der femoral Ader des bewussten Cynomolgus Affen vorbereitet (n = 50). Gesamt-RNS war mit im Handel erhältlichen System extrahiert. Plasma-MiRNAs wurden durch Testbasierte RT-qPCR-Assays die MiRNA-spezifische Vor-/Rücklauf PCR Primer und Sonde enthält quantifiziert. Standardkurven für absolute Quantifizierung wurden mit handelsüblichen synthetische RNA-Oligonukleotide erzeugt. Eine synthetische Cel-MiR-238 diente als eine externe Steuerung für die Normalisierung und Qualität. Die MiRNAs, die Quantifizierung Zyklus (Cq) Werte über 35 gezeigt wurden vorverstärkt vor dem qPCR-Schritt.
Unter den 8 MiRNAs untersucht waren MiR-122, MiR-133a und MiR-192 nachweisbar ohne Vorverstärkung, während MiR-1 und MiR-206 MiR 499a Vorverstärkung aufgrund ihrer niedrigen Ausdruck erforderlich. MiR-208a und MiR 208b waren auch nach Vorverstärkung nicht nachweisbar. Probe Verarbeitungseffizienz wurde durch die Cq-Werte von Spike Cel-MiR-238 bewertet. Bei diesem Assay-Verfahren technische Variation war schätzungsweise weniger als 3-fold und die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) war 102 Kopie/µL, für den Großteil der untersuchten MiRNAs.
Dieses Protokoll ermöglicht eine bessere Schätzung der Menge an Plasma MiRNAs und Qualitätsbeurteilung von entsprechenden Daten aus verschiedenen Studien ermöglicht. Wenn man bedenkt, dass die geringe Anzahl von MiRNAs in Körperflüssigkeiten, Vorverstärkung nützlich zur Erkennung von schlecht zu verbessern ist, äußerte MiRNAs.

Workflow der MiRNA-Assay von RT-qPCR und Qualität Assessment Abbildung 1 zeigt den Workflow der MiRNA-Assay aus Blutproben mit qPCR10. Die Qualität der Versuche kann durch einschließlich Cel-MiR-238 als eine externe Kontrolle überprüft werden. Dadurch wird erkennbar, dass technische Variationen in RNA-Extraktion und anschließende RT-qPCR verarbeitet. In dieser Studie wurde der Mittelwert ± SD der Cq-...

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Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Messung der absoluten Werte der Plasma MiRNA, quantitative Real-Time reverse Transkription PCR verwenden, mit oder ohne Vorverstärkung. Dieses Protokoll bietet besseres Verständnis für die Menge an Plasma MiRNAs und qualitative Bewertung der entsprechenden Daten aus verschiedenen Studien oder Labors ermöglicht.

Absolute Quantifizierung von MicroRNA-Plasmaspiegel bei Cynomolgus Affen, über Quantitative Real-Time Reverse Transkription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

absolute-quantification-plasma-microrna-levels-cynomolgus-monkeys

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Aufrufe.  Daiichi Sankyo Co., Ltd.. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Messung der absoluten Werte der Plasma MiRNA, quantitative Real-Time reverse Transkription PCR verwenden, mit oder ohne Vorverstärkung. Dieses Protokoll bietet besseres Verständnis für die Menge an Plasma MiRNAs und qualitative Bewertung der entsprechenden Daten aus verschiedenen Studien oder Labors ermöglicht.

Serie: Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Forschung

Biologie

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Mittels quantitativer Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...