Diese Arbeit wurde unterstützt vom National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health durch gewährt, 5P20GM103636-02 (einschließlich Flow Cytometry-Core-Support) und 1R01GM121703, sowie Auszeichnungen aus dem Oklahoma-Center für die adulten Stammzellen Forschung.

Alle Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit Protokollen, die durch die Oklahoma Medical Research Foundation institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt behandelt.
1. Einrichten von Erwachsenen Zebrafisch für die Zucht
<ol><li>Eine große Kohorte von erwachsenen männlichen und weiblichen Zebrafisch eines einzigen Stammes zur Zucht zu verwenden. Es gibt kleine Unterschiede in der genetischen Zusammensetzung der Zebrafisch sogar eines einzelnen Stammes, eine große Kohorte zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse repräsentativ für die genetische Variabilität der Bevölkerung und nicht beschränkt auf einen kleinen Teil der Bevölkerung sind.</li>
	<li>Am Vorabend Embryonen gesammelt werden, Dutzende von Zucht Erwachsene in Zucht Panzer, verwenden Sie etwa gleicher Anzahl von Männchen und Weibchen zu. Je nach dem Experiment verwenden Sie eine der folgenden Zuchtstrategien.<ol>
<li>Zucht-Strategie 1: Legen Sie ein paar männliche und weibliche Zebrafisch in einzelnen Zucht Panzer, die Männchen von den Weibchen mit einem Raumteiler trennen. Wenn dieser Ansatz verwendet wird, viele verschiedene Zucht Panzer setup und bündeln die Embryonen aus jedem um sicherzustellen, dass die biologische Variabilität ist repräsentativ für die Bevölkerung.</li>
		<li>Zucht von Strategie 2: Dutzende von männlichen und weiblichen Zebrafisch in einem großen Zucht-Tank zu kombinieren. Diese Strategie verwenden, solange gibt es eine ausreichend große Anzahl von Embryonen, ist es vernünftig anzunehmen, sie kamen aus einer Vielzahl von Gründern und sind daher genetisch repräsentativ für die Bevölkerung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) zeitlich Paarungen - Sammlung, Sortierung und Gehäuse Zebrafisch-Embryonen für Experimente
<ol><li>Durchführen Sie zeitgesteuerte Paarungen beginnen, sobald das Licht Zyklen morgens. Entsorgen Sie alle Embryonen erzeugt über Nacht.</li>
	<li>Erlauben Sie Fische zu züchten in seichtem Wasser (3-5 cm) für einen Zeitraum von 10 min, mit doppeltem Boden für Embryonen durch zu entkommen.</li>
	<li>Nach 10 Minuten sammeln Sie Embryonen durch durch ein Sieb Gießen und in einem 10-cm-Platte mit einer Waschflasche spülen. Pool alle Embryonen zum gleichen Zeitpunkt gesammelt markieren sie mit der Sammlung und Stelle sofort in einem Inkubator bei 28,5 ° C.</li>
	<li>Hunderte von Embryonen können von einem einzigen Paarung Paar an einem Tag zu rechnen. Können Sie Erwachsene, in 10 min zu züchten Zyklen, bis die Anzahl der Embryonen gewonnen, die weniger als 20 ist.</li>
	<li>Ca. 1-1,5 h nach der Entnahme, Art Embryonen, Tote und unbefruchtete Embryonen zu entfernen. Zum Sortieren von Embryonen Inkubator entnehmen und unter dem sezierenden Mikroskop beobachten.<ol>
<li>Anzahl der Embryonen und Ort bei einer Dichte von 100 Embryonen pro 10 cm Platte.</li>
		<li>Frisches E3-Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) hinzufügen und Embryonen in den Inkubator 28,5 ° C zurück.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Dechorionate, deyolk und Zebrafisch-Embryonen zu beheben
Hinweis: Dieser Abschnitt des Protokolls richtet sich an Embryonen vor 48 h Post Düngung (hpf). Besteht keine Notwendigkeit, die Chorions Embryonen in einem späteren Stadium der Entwicklung zu entfernen (nach 48 hpf), da sie oft natürlich abfallen. Es gibt keine Notwendigkeit, deyolk oder Entfernen des Chorions Fische älteren post 5 Tage Düngung (Dpf).
<ol><li>Wenn Embryonen gewünschte Entwicklungsalter erreicht haben, überprüfen Sie entsprechenden Entwicklungsstand morphologisch unter einem Lichtmikroskop nach "Stadien der embryonalen Entwicklung der Zebrafisch"17.</li>
	<li>Übertragen Sie bis zu 1500 inszenierte Embryonen auf eine 15 mL konische Rohr und waschen Sie mehrmals mit E3.<ol>
<li>Fügen Sie 1 mL der E3 und 20 µL Pronase-Lösung (30 mg/mL) für jeden 100 Embryonen und Schwenken Sie sanft. Dechorionated in einer einzigen Röhre mit 15 mL E3 können bis zu 1500 Embryonen werden.</li>
		<li>Legen Sie Rohr auf die Seite und ordnen Sie Embryonen in einer gleichmäßigen Schicht auf maximale Oberfläche, Volumen-Verhältnis zu gewährleisten. Schütteln Sie sanft Rohr alle 2-3 Minuten bis alle Chorions gesunken Weg von der Embryonen. Die gesamten Dechorionation Zeit variiert je nach Pronase Aktivität.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie überstand und spülen Sie sanft Embryonen 3 Mal mit 10 mL der E3. Embryonen auf Eis für den Rest dieses Abschnitts des Protokolls zu platzieren.</li>
	<li>E3 zu entfernen und waschen Embryonen mit frisch zubereiteten eiskalte Deyolking Puffer (0,5 x Ginzburg Fisch Ringer-Lösung, ohne Calcium: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1,25 mM Nahco33).<ol>
<li>Fügen Sie 1 mL eiskaltes Deyolking Puffer für bis zu 500 Embryonen.</li>
		<li>Mit einem P1000 sanft pipette Embryonen nach oben und unten 5 - 10 mal Eigelb Sack zu stören.</li>
		<li>Übertragen Sie 1 mL auf eine 1,5 mL Microfuge Rohr- und Zentrifuge bei 4 ° C und 500 X g für 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie überstand und waschen Pellet mit 1 mL eiskaltes 1 X PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,0), Ringer Lösung zu entfernen. Zentrifuge bei 4 ° C und 500 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Sorgfältig entfernen Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Zellen in 1 mL 1 X PBS. Legen Sie Rohr auf Eis.</li>
	<li>Eine 15 mL konische Rohr 3 mL eiskaltes Ethanol (EtOH) hinzufügen. Wirbelröhre von EtOH sanft auf Einstellung "niedrig".<ol>
<li>Verwenden sanft ein P1000, langsam (1 Tropfen pro Sekunde) Tropf Zebrafish Embryos Zellsuspension in EtOH beim aufschütteln.</li>
		<li>Fügen Sie eine Gesamtmenge von 1 mL der Embryo Zellsuspension für eine endgültige Fixierung-Lösung von 75 % EtOH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach 1 mL der Zelle wurde Aussetzung hinzugefügt, sanft Wirbel Rohr zu mischen und bei-20 ° C für mindestens 1 h. Es empfiehlt sich, legen Sie die Rohre auf ihrer Seite zu gewährleisten maximale Fläche zum Volumenverhältnis und reduzieren Sie die Anzahl der Embryonen und Zellen, die aneinander kleben. Speichern Sie embryonaler Stammzellen bei-20 ° C für ca. 2-3 Wochen.</li>
</ol>(4) Färbung der DNA und FACS Sortierung Embryonen
Hinweis: Dieser Abschnitt des Protokolls richtet sich an Embryonen im 1 Dpf.
<ol><li>EtOH-feste embryonaler Stammzellen von-20 ° C und Zentrifuge bei 4 ° C 1500 X g für 5 min zu entfernen.<ol>
<li>Legen Sie Rohr auf Eis und sorgfältig entfernen überstand. Mit einem P1000, sanft Aufschwemmen Sie Zellen in 1 mL frisch zubereiteten kalten PBS-BSA (1 X PBS, 1 % Rinderserumalbumin).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie Zellen bei 4 ° C und 1500 X g für 5 min und auf Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für jede 1000 Embryonen verwenden entfernen überstand und Aufschwemmen Zellen in Propidium Jodid (PI) Färbelösung (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0), 200 µL.<ol>
<li>Können Sie Zellen in PI-Lösung für 30 min auf Eis, sanft mischen alle 5 min inkubieren.</li>
		<li>Legen Sie ein 40 µm Nylon Zelle Sieb auf eine 50 mL konische Rohr auf Eis. Pipette vorsichtig Zellen zu mischen und durch das Gitter zu filtern. Hinweis: Wenn mehrere Röhren von Embryonen aus der gleichen Timepoint in Abschnitt 3 des Protokolls gesammelt wurden, kombinieren Sie diese Embryonen an dieser Stelle, dass sie alle zusammen sortiert werden.</li>
		<li>Nutzung der Wohnung im inneren Ende ein Spritzenkolben, sanft stören Sie alle restlichen Klumpen von Zellen auf dem Netz.</li>
		<li>Spülen Sie Zellen durch den Filter mit 500 µL kaltem PBS-BSA für jede 1000 Embryonen.</li>
		<li>Platzieren Sie ein 40-µm-Netz über eine 15 mL konische Rohr auf Eis und Filtern Sie die Zellsuspension aus dem 50 mL konische Röhrchen ein zweites Mal in die 15-mL-Tube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie mithilfe einer entsprechenden Zelle Sortieren Instrument die Laseranregung auf 561 nm und Emission Detection 610/20 Propidium Jodid zu erkennen.<ol>
<li>Mix 15-mL-Tube von gefärbten Zellen kurz durch aufschütteln und Platz im Instrument bei 4 ° C.</li>
		<li>Führen Sie Zellen bei einer langsamen Flow rate, idealerweise 1,0 mL/min, um eine saubere Zellzyklus-Profil zu erhalten und zu vermeiden, mischen G1 oder G2/M-Zellen mit dem S phase Bevölkerung.</li>
		<li>Erstes Tor für FSC-A X SSC-A (forward Scatter-Bereich durch Streuung Seitenbereich), Schmutz (Abbildung 1A). Hinweis: Zellen aus Embryonen können Größen je nach Stadium und Zelle unterschiedlich. Die Graufilter (ND) kann zwischen 1.0 und 1.5 abhängig von der Größe der Zellen vorhanden gewechselt werden müssen. Tor, ein großes Gebiet zu sammeln die meisten Zellen und Schmutz zu entfernen.</li>
		<li>Zweite, Tor für SSC-Bereich (SSC-A) von PI-Bereich (PI-A), um Schmutz und Zelle Dubletten (Abbildung 1 b) zu entfernen.</li>
		<li>Drittens: Tor für SSC-A von SSC-W (Breite), alle restlichen Zelle Dubletten (Abbildung 1) zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anzeigen der gated Populationen auf ein Histogramm mit Handynummer (Anzahl) auf der y-Achse und Propidium Jodid-Bereich (PI-A) auf der x-Achse. Dies sollte für 24 hpf Embryonen eine stereotype Zellzyklus-Profil wie in Abbildung 1geben.<ol>
<li>Um die Bevölkerung der Phase zu sortieren, setzen Sie das Tor von der rechten Seite des G1 Peak auf der linken Seite der G2 Spitze, darunter nur eine minimale Menge an der G1 und G2 Bevölkerung. Für 24 hpf Embryonen wird dies in der Regel ca. 10-15 % der gated Bevölkerung umfassen (siehe Abbildung 1).</li>
		<li>Um die G1-Bevölkerung zu sortieren, legen Sie das Tor auf der linken Seite der G1 Spitze, der Gipfel des Berges nicht übergeben. Passen Sie die Breite des G1 Tores so schmal wie möglich (siehe Abbildung 1).</li>
		<li>Tor der G1 und S Phase Bevölkerungen zu den richtigen ersten gating (Abbildung 1E) sorgen zurück.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sortieren Sie die G1 und S Phase Populationen in 15 mL konische Röhrchen mit 3 mL PBS-BSA. Das Ziel sollte sein, um zwischen 500.000 und 1 Million oder mehr sortierten Zellen pro angebrochene (G1 und S-Phase) zu erhalten.</li>
	<li>Nach Sortierung abgeschlossen ist, Röhren Zentrifuge bei 1500 x g und 4 ° C für 10 Minuten. Hinweis: Das kleinzellige Pellet wird schwierig sein, zu sehen und es ist wichtig, nicht zu stören, dass es, so verwenden Sie am besten einen schwingende Eimer Rotor über einen festen Winkel-Rotor.</li>
	<li>Sorgfältig entfernen Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Pellet mit 1 mL 1 X PBS. Übertragen Sie Zellen auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr- und Zentrifuge bei 6.000 x g und 4 ° C für 5 min.</li>
	<li>Sorgfältig entfernen Sie alle Flüssigkeit aus Rohr und frieren Sie trocken Pellet bei-20 ° C ein. Speichern Sie die Pellets bei-20 ° C für ca. 2-3 Wochen.</li>
</ol>(5) DNA-Isolierung, RNase-Behandlung und DNA-Reinigung
<ol><li>Entfernen Sie Zelle Pellet aus-20 ° C und auf Eis.<ol>
<li>Fügen Sie 400 µL SDS Puffers (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5 % SDS), Pellets und erneut hinzu.</li>
		<li>Eine Endkonzentration von 0,2 mg/mL Proteinase K hinzu und durch Vortexen kurz mixen.</li>
		<li>Inkubieren Sie Proben bei 56 ° C für 2 h, Wirbel alle 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchführen Sie nach 2 h Phenol-Chloroform Extraktion durch Hinzufügen von 400 µL Phenol-Chloroform (Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol 25:24:1, gesättigt mit 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA).<ol>
<li>Vortex für 20 s und Zentrifuge Probe bei 16.000 x g für 5 min, Phasen zu trennen.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase (400 µL) und Übertragung auf einen 1,5 mL-Tube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchführen Sie EtOH Niederschlag durch Hinzufügen von 40 µL 3M Natriumacetat (pH 5,2), 2 µL von Glykogen und 1 mL EtOH.<ol>
<li>Vortex mischen und bei-20 ° C über Nacht, DNA auszufällen. Probe kann auch bei-80 ° C oder auf Trockeneis für 1 h ausgefällt werden.</li>
		<li>Zentrifuge Probe bei 4 ° C und 16.000 x g für 30 min an der Pellet-DNA.</li>
		<li>Ablagestapel überstand und waschen Pellet mit 1 mL 70 % EtOH. Zentrifuge bei 4 ° C und 16.000 x g für 5 Minuten.</li>
		<li>Überstand und an der Luft trocknen Pellet bei Umgebungstemperatur für 2-3 min zu verwerfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lösen Sie Pellets in 96 µL autoklaviert Wasser auf, und fügen Sie 4 µL RNase A (2 mg/mL).<ol>
<li>Mischen Sie gut durch aufschütteln und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchführen Sie Phenol-Chloroform Extraktion durch Zugabe von 100 µL Phenol-Chloroform und folgt in Schritten 5.2.1 - 5.2.2.</li>
	<li>Durchführen Sie EtOH Niederschlag durch Hinzufügen von 10 µL 3M Natriumacetat, 1 µL Glykogen und 250 µL EtOH und nach dem Eingriff in Schritten 5.3.1 - 5.3.5.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Pellet in 60 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH8.0)) und bestimmen Sie DNA-Konzentration mit einer quantitativen Fluoreszenz basierende Methode zu. Shop DNA bei-20 ° C. Hinweis: Es ist wichtig, DNA mit Hilfe von Fluoreszenz-basierte DNA-bindende Farbstoffe oder auf andere Weise zuverlässiger als UV-Spektrometer-basierte Methoden zu quantifizieren.</li>
</ol>6. Vorbereitung der DNA-Bibliotheken und Sequenzierung der nächsten generation
Hinweis: Ein G1 Kopie Nummer Rückstellmuster für jede biologische Quelle ist erforderlich für jeden Lauf Sequenzierung (d.h. WT, mutierten, Transgene, Zell-Linie, etc.). Vergleichen Sie alle S-Phase-Proben aus der gleichen biologischen Quelle in der gleichen Sequenzierung ausgeführt, um die gleiche G1-Referenz. Führen Sie mindestens zwei biologische Wiederholungen jeder Probe zur Sicherstellung der Konsistenz zwischen Proben.
<ol><li>Verdünnen Sie 1 µg DNA zu einem Endvolumen von 50 µL und Transfer zu einem spezialisierten Schlauch für Beschallung.</li>
	<li>Scheren Sie genomischen DNA für ein Ziel von 250-300 bp in einem fokussierten Ultrasonicator nach Hersteller Vorgaben und Protokoll.</li>
	<li>Qualität und Größe der geschert genomischer DNA, die eine automatisierte Elektrophorese maschinenbenutzung nach Vorgaben und Protokoll des Herstellers zu überprüfen. Stellen Sie sicher, es gibt eine große Spitze von ~ 250-300 bp für die sheared genomischer DNA.</li>
	<li>Bereiten Sie Sequenzierung Bibliotheken mit einer DNA-Bibliothek vorbereitungssatz mit Multiplex-Oligos für Sequenzierung auf Illumina-Plattform vor, laut Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Qualität der Bibliothek Prep automatisierte Elektrophorese-Automaten, laut Protokoll des Herstellers zu überprüfen. Stellen Sie sicher, es gibt eine große Spitze von ~ 400-450 bp, und es gibt minimale Spitzen für Grundierung Dimere (80-85 bp) und Adapter Dimere (~ 120 bp).</li>
	<li>Bibliotheken mit den DNA-Bibliothek Quantifizierung Kit für DNA-Sequenzierung der nächsten Generation, laut Protokoll des Herstellers zu quantifizieren.</li>
	<li>Verdünnte 15 µL der Bibliothek zu einer Konzentration von 5 nM und kombinieren gemultiplext Bibliotheken, wie erforderlich, um zu erzielen gewünscht eindeutig Zuordnung lesen zählt pro Probe. Hinweis: Die Anzahl der eindeutigen Zuordnung Lesevorgänge pro Probe wird die Auflösung zu bestimmen. Verwendung so wenig wie 5 Millionen abgebildet liest Replikation Timing für das Zebrafish Genom zu beurteilen. Es wird empfohlen, die beginnen mit 10 Millionen mal gelesen.</li>
	<li>Führen Sie gepaart-End 100 bp ganze DNA-Sequenzierung des Genoms von Proben auf ein next Generation Sequencing-Plattform gemäß Anweisungen des Herstellers.</li>
</ol>7. Analyse der Sequenzierungsdaten
Hinweis: Die Anweisungen in diesem Abschnitt sollen als Richtlinie für die Analyse. Verwenden Sie zusätzliche Methoden zur Sequenzierung Ausrichtung, Filterung, Verarbeitung usw.. In diesem Abschnitt des Protokolls wird die bevorzugte Methode der Analyse in dieser Arbeit behandelt. Wenn zusätzliche Methoden verwendet werden, passen Sie die Parameter und Funktionen für diese Zwecke. Die folgenden Befehle werden in Ubutnu oder Mac terminal, mit die entsprechenden Pakete installiert eingetragen.
<ol><li>Erhalten Sie die neuesten Versionen des Zebrafisch-Genoms (danRer10, ab wann dieses Protokoll geschrieben wurde) von UCSC Genom Browser mit den folgenden Befehlen: Wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz<ol>
<li>Dekomprimieren Sie die Datei fa.gz mit dem folgenden Befehl: Gunzip danRer10.fa.gz</li>
		<li>Richtet die Sequenzierungsdaten zum Genom mit BWA-Mem mit den folgenden Befehlen: BWA Mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam</li>
	</ol>
</li>
	<li>.Bam-Datei mit Samtools mit dem folgenden Befehl umwandeln Sie .sam Datei: Samtools anzeigen -bS input.sam > output.bam<ol>
<li>Sortieren Sie die ausgerichteten Sequenzierung Dateien mithilfe von Samtools mit dem folgenden Befehl: Samtools sortieren output.bam > output_sorted.bam</li>
		<li>Indizieren Sie die .bam-Datei mit Samtools mit den folgenden Befehl: Samtools Index output.bam</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mark PCR Duplikate mit Picard mit den folgenden Befehlen: Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \ Input=Input.BAM Output=Output.BAM REMOVE_DUPLICATES = False METRICS_FILE=output_metrics.txt</li>
	<li>Generieren Sie Textdateien (.txt) liest für jedes Chromosom mit dem folgenden Befehl: für i in {1.25}; tun CHROM = "chr" $i; Echo $CHROM; Samtools anzeigen input.bam $CHROM | Schneiden -f 2,4,5,7,8,9 > ReadsChr$ {i} .txt; fertig Hinweis: Die Spalten in der resultierenden .txt-Datei sind Flagge, Standort, MapQ, koppeln chr, paar Lage und Fragmentgröße, beziehungsweise.</li>
	<li>Matlab (oder andere ähnliche Software) über die Textscan Funktion gelesen Sie txt-Dateien ein.<ol>
<li>Niedrige Abbildung Qualität liest durch Festlegen einer MapQ Schwellenwerts von 30 herausfiltern.</li>
		<li>Entfernen Sie liest mit Fahnen für nicht primäre Ausrichtung, PCR Duplikate oder paar-Mapping auf einem anderen Chromosom.</li>
		<li>Jeder liest mit ihren paar jenseits der Schwelle eine Entfernung von 2000 bp herausfiltern.</li>
		<li>Bewerten Sie Statistiken des daraus resultierenden lautet, Anzahl lesen Sie Statistiken, Abdeckung, Plattengröße und Qualität (Abbildung 2) zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lesen Sie Berichte auf 100 bp behoben Windows für jede Probe durch zählen der Anzahl der Lesevorgänge in 100 bp Intervallen über die Länge jedes Chromosoms zu bestimmen.<ol>
<li>Berechnen Sie der Median Anzahl für alle Fenster zu lesen.</li>
		<li>Regionen der hohen Abdeckung durch Entfernen von Windows, die größer als 5 Standardabweichungen vom Medianwert herausfiltern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Regionen für die Analyse in der G1-Referenzproben zu definieren, mit 200 liest mit Schiebefenster Segmente entlang jedes Chromosom zu finden.<ol>
<li>Bestimmen Sie lesen Sie Tiefe in jeder S-Phase-Probe durch zählen der Anzahl der S-Phase-Lesevorgänge im Fenster 200 lesende Graf für die begleitenden G1 Referenz definiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Glätten Sie die raw-Daten über die Csaps-Funktion in die Software mit einem Interpolationsfaktor (p) von 10-16.</li>
	<li>Geglättete Daten zu Z-Score mit einem Mittelwert von 0 und Standardabweichung von 1 zu normalisieren.</li>
</ol>

<ol><li>Rhind, N., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3721284/">DNA replication timing.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).</li>
<li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li>
<li>Rivera-Mulia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+replication+timing+and+gene+expression+during+lineage+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).</li>
<li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), e245(2008).</li>
<li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+dynamics+of+replication+timing+revealed+by+in+vitro+models+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis.</a> Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+relationship+of+DNA+replication+timing+to+different+forms+of+human+mutation+and+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation.</a> Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).</li>
<li>Ryba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+developmental+control+of+replication-timing+domains+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).</li>
<li>Sima, J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+correlations%3A+replication+timing+and+mutational+landscapes+during+cancer+and+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution.</a> Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).</li>
<li>Veldman, M. B., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).</li>
<li>Link, B. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-1-59745-285-4_13">Zebrafish as a Model for Development.</a> Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).</li>
<li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).</li>
<li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).</li>
<li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li>
<li>Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing+during+development+anticipates+transcriptional+programs+and+parallels+enhancer+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation.</a> Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Zebrafisch bieten ein neues und einzigartiges in Vivo Modell, DNA-Replikation Timing zu studieren. Wenn zeitliche Verpaarungen erfolgen als detailliert in diesem experimentellen Protokoll, Tausende von Embryonen können gesammelt werden, an einem einzigen Tag für Experimente. Diese Embryonen entwickeln sich synchron durch präzise getimten und deutlich zeichnet sich Phasen der Entwicklung. Zebrafisch kann leicht und präzise durch Morphologie mit einem Stereomikroskop wie Zebrafisch-Embryonen entwickeln sich na...

Für die Zellen sich zu teilen erfolgreich müssen sie zuerst genau und treu ihre gesamte Genom repliziert werden. Genom Verdoppelung tritt in einem reproduzierbaren Muster, bekannt als der DNA-Replikation Timing Programm1. DNA-Replikation Timing korreliert mit Chromatin Organisation, epigenetischen Markierungen und Gen Ausdruck2,3. Änderungen im Timing der Replikation treten während der gesamten Entwicklung und sind deutlich Bezug auf transkriptioneller Programme und Änderungen zum Chromatin Marken und Organisation4,5. Darüber hinaus Replikation Timing ist korreliert mit mutagenen Frequenzen, und Änderungen im Timing in verschiedenen Arten von Krebs6,7,8eingehalten werden. Trotz dieser Beobachtungen die Mechanismen und Determinanten der Replikation Timing Errichtung und Ordnung sind noch weitgehend unbekannt, und es spielt die Rolle in der Entwicklung und Krankheit ist unbestimmt. Darüber hinaus hatte bis vor kurzem die genomweite Replikation timing während der vertebrate Entwicklung auftretende Änderungen nur in Kultur zellmodellen untersucht worden.
Zebrafisch, Danio Rerio, eignen sich gut, Replikation Timing in Vivo während der Entwicklung zu studieren wie ein einzelnes Paarung paar Hunderter von Embryonen, die entwickeln sich rasch mit vielen Ähnlichkeiten zu Säugetier-Entwicklung9hervorbringen kann, 10. Darüber hinaus gibt es während der gesamten Entwicklung der Zebrafisch, Änderungen in den Zellzyklus, Chromatin Organisation und transkriptionelle Programmen, die Beziehungen mit DNA-Replikation Timing11teilen. Zebrafisch sind auch ein hervorragendes genetisches Modell, wie sie sind besonders offen für Manipulation durch Transgenese, Mutagenese und gezielte Mutationen und genetischen Bildschirme haben viele Gene, die erforderlich für vertebrate Entwicklung12identifiziert. Daher kann Zebrafisch, Replikation Timing Aufbau und die Pflege beteiligten Gene zu identifizieren und um die Auswirkungen der Deregulierung Replikation Timing auf vertebrate Entwicklung beobachten verwendet werden. Transgene Linien können auch zur Replikation Timing von einzelnen Zelltypen isoliert an verschiedenen Zeitpunkten Entwicklungsstörungen oder Krankheiten zu beurteilen. Wichtig ist, gibt es verschiedene Zebrafisch Modelle menschlicher Erkrankungen, die verwendet werden, um die Rolle der Replikation Zeitmessung in Krankheit Entstehung und Progression9,13,14zu untersuchen.
Vor kurzem wurden die erste Replikation Timing Profile von Zebrafisch als Modellsystem Replikation timing in Vivo15studieren generiert. Um dies zu erreichen, wurden die Zellen von Zebrafisch-Embryonen in mehrere Phasen der Unternehmensentwicklung und in einem Zelltyp isoliert von Erwachsenen Zebrafisch gesammelt. Zellen wurden dann sortiert nach FACS, die anhand der DNA-Gehalt (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung), G1 und der S-Phase-Bevölkerung zu isolieren. Kopieren Sie mithilfe der G1-Probe als eine Nummer Kopiersteuerung Nummer Variationen in S-Phase Populationen wurden ermittelt und verwendet, um relative Replikation Timing16ableiten. Änderungen im Zeitplan der Replikation können dann direkt zwischen verschiedenen Entwicklungsstörungen Proben und Zelltypen verglichen werden, und dies wurde verwendet, um Änderungen im Timing der Replikation zu ermitteln, die in Vivo in vertebrate Entwicklung auftreten. Diese Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen genomischen Methoden, vor allem, dass es keine Kennzeichnung mit Thymidin-Analoga oder Immunopräzipitation DNA4,6.
Hier wird detailliert die Protokolle zum Profil genomweite DNA Replikation Timing bei hochauflösenden im Zebrafisch. Diese Protokolle wurden zur Beziehungen mit genomischen und epigenetische Features in das Zebrafish Genom, sowie die Profilierung Änderungen in diesen Beziehungen, die auftreten, während der Entwicklung zu bestimmen. Diese Protokolle sind auch leicht angepasst, um Veränderungen in Replikation Timing im mutierten Zebrafisch-Stämme und in Krankheitsmodellen zu studieren. Darüber hinaus bieten diese Methoden eine Stiftung, die Replikation Timing in bestimmten Zelltypen zu studieren, durch erste Aussortieren der einzelnen Zelltypen aus dem Zebrafisch erweitert werden kann. Der Zebrabärbling dient als eine ausgezeichnete in Vivo Modellsystem zu Replikation Timing zu studieren und letztlich die biologischen Funktionen von dieser wichtige epigenetische Eigenschaft offenbaren.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>EMD Millipore</td><td>MMX00701</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td>protease solution</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>KOPTEC</td><td>V1016</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9844</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24950</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform</td><td>Sigma</td><td>P3803-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>J.T.Baker</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Quanit-iT</td><td>Invitrogen</td><td>Q33130</td><td>Reagents for fluorescence-based DNA quantification</td></tr><tr><td>Covaris AFA microTUBE</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>specialized tube for sonication</td></tr><tr><td>Covaris E220 Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E220</td><td>focused ultrasonicator</td></tr><tr><td>Agilent 4200 Tapestation</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>automated electrophoresis machine</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td>Reagents for automated electrophoresis machine</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>Cat#E7370L</td><td>DNA library preparation kit</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7335S</td><td>multiplex oligos for DNA library preparation kit</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7500S</td><td>additional multiplex oligos for DNA library preparation kit</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7630L</td><td>quantification kit for library preparation</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>magnetic beads</td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&amp;ndash;401&amp;ndash;2501</td><td>next generation DNA sequencing platform</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Falcon Nylon Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100</td><td>VWR</td><td>89078-446</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color</td><td>Denville Scientific</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Dnase/Rnase free</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Wash Bottles</td><td>VWR</td><td>16650-022</td><td>Low-Density Polyethylene, Wide Mouth</td></tr><tr><td>Strainer</td><td>VWR</td><td>470092-440</td><td>6.9 cm, fine mesh</td></tr><tr><td>Corssing tank</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>individual breeding tank</td></tr><tr><td>iSpawn</td><td>Techniplast</td><td>N/A</td><td>large breeding tank</td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD biosciences</td><td>N/A</td><td>cell sorting machine</td></tr><tr><td>Wild M5a steromicroscope</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>N/A</td><td>dissecting microscope</td></tr><tr><td>Qubit 3 Fluorometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33216</td><td>quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>version 2017a</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Statistics Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>version 11.1</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Curve Fitting Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>version 3.5.5</td><td></td></tr></tbody></table>

profiling dna replication timing using zebrafish as an in vivo model system

DNA-Replikation Timing ist eine wichtige zelluläre Eigenschaft, wichtige Beziehungen mit Chromatinstruktur, Transkription und DNA Mutationsraten ausstellen. Änderungen im Zeitplan der Replikation auftreten während der Entwicklung und in der Krebstherapie, aber die Rolle Replikation Timing spielt in der Entwicklung und Krankheit ist nicht bekannt. Zebrafisch entstanden vor kurzem als in Vivo Modellsystem Replikation Timing zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung der Zebrabärbling zur DNA-Replikation Zeitpunkt bestimmen. Nach der Sortierung der Zellen aus Embryonen und Erwachsenen Zebrafisch, können hochauflösende genomweite DNA Replikation Zeitverzögerungsmuster konstruiert werden, durch die Bestimmung der Veränderungen der DNA-Kopienzahl durch Analyse der nächsten Generation Sequencing-Daten. Der Zebrafisch-Modell-System ermöglicht eine Auswertung der Replikation Timing Veränderungen, die auftreten, während der gesamten Entwicklung in vivo, und kann auch zu Veränderungen in einzelnen Zelltypen, Krankheitsmodelle oder mutierten Linien verwendet werden. Diese Methoden ermöglichen es Studien untersuchen die Mechanismen und Determinanten der Replikation Timing Aufbau und die Pflege während der Entwicklung, die Rolle Replikation Timing spielt in Mutationen und Tumorgenese und die Auswirkungen der erkunden Replikation Timing auf Entwicklung und Krankheit.

Verwendung von veröffentlichten Replikation Zeiterfassungsdaten, repräsentative Replikation Timing Profile und Qualitätssicherungsmaßnahmen15angeboten. Die ersten Schritte der Verarbeitung beinhalten Ausrichten der Sequenzierungsdaten, das Genom, Berechnung lesen Sie Länge und Genom Abdeckung Statistiken und geringe Filterqualität ungepaarte, und PCR-doppelte liest. Lesen Sie Statistiken für eine typische Zebrafisch Sequenzierung Probe werden in <strong clas...

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Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

profiling-dna-replication-timing-using-zebrafish-as-an-vivo-model

Research

JoVE Journal

Genetics

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

7.8K Aufrufe.  Oklahoma Medical Research Foundation. Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.

Serie: Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Genetik

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszierende Proteinmarkierung in Zebrafischlarven mittels CRISPR/Cas9-Knock-in

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Biologie

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

Zusammenfassung

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Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert