Die Autoren möchten James Fosse für seine hervorragende Arbeit auf allen Videografie und Videoverarbeitung danken; Michael Marti für seine hervorragende Arbeit bei der Erzeugung von digitalisierten Rinder Bilder; Lilia Walther für ihre Hilfe mit RNA-Extraktion und Bioanalyzer läuft; Mitch Palmer und Carly Kanipe für ihre hilfreiche Bewertung und Feedback auf Lymphknoten Bilder; und die Tierpflege und Tierärzten bei der National Animal Disease Center für all ihre harte Arbeit und Unterstützung bei der Tierhaltung und der Vorbereitung auf Autopsien.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen. Alle Forschung wird mit intramurale Mittel aus dem US Department of Agriculture, Agricultural Research Service finanziert. Alle Verweise auf bestimmte Produkte werden für die Zwecke der experimentellen Reproduzierbarkeit zur Verfügung gestellt und stellen keine Billigung dieser Produkte durch die Bundesregierung.

Die Mehrheit der transkriptomischen Studien und die dazugehörigen Protokolle auf Maus, Ratte oder Post-Mortem Humanproben konzentrieren. Jedoch bieten Untersuchungen in Vieh und Wildtiere eine breite Palette von Möglichkeiten für die Charakterisierung der Immunantwort gegen Krankheiten, sowohl als für Veterinärmedizin und in Bezug auf zoonotische Krankheiten, für die menschliche Gesundheit. Dieses Protokoll zur Verfügung gestellt, einer Übersicht der wichtigsten Überlegungen für hoher Integrität RNA-Extraktion...

RNA-Sequenzierung Analyse des transkriptoms Lymphknoten bietet die Möglichkeit, die Immunantwort von Tieren zu einer Vielzahl von Krankheitserregern zu charakterisieren. Während diese Methode bei Mäusen ausgiebig genutzt wurden, haben vor kurzem Analysen in größeren Säugetiere1,2ausgebaut. Vieh/großes Tier Lymphknoten kann verwendet werden, um Host Reaktion auf eine Infektion, nicht nur für den Gebrauch im Impfstoff oder genetische Anfälligkeit Studien und für die Identifizierung von Zielen für die Entwicklung von Medikamenten, sondern auch als Modellsysteme für Studien am Menschen zu charakterisieren über Zoonosen. Zum Beispiel im Falle von Brucellose (eine bakterielle Zoonose, dass Auswirkungen eine halbe Million auf der ganzen Welt jedes Jahr Menschen), trotz deutlich erhöhte Kosten, Studien bei Schafen oder Ziegen sind relevanter für die Infektion beim Menschen und menschliche Impfstoff Entwicklung als Labor Tiermodelle. Maus Infektionsmodelle rekapitulieren die retikuloendothelialen System Infektion aber nicht die charakteristischen klinischen Symptome3.
Im großen Tierversuch im Vergleich zu tierischen Laborstudien umfasst den Prozess des Gewebes Ernte unbedingt eine längere Verzögerung zwischen der Euthanasie und die Gewebe-Kollektion, die eine mögliche für die Erhaltung der Herausforderung qualitativ hochwertige RNA. Intakte RNA ist essentiell für die Generation der biologisch relevanten transkriptomischen Daten. Die Erzeugung von qualitativ hochwertigen RNA aus Gewebeproben erfolgt im Containment Einrichtungen für große Tiere Pathogen Studien besonders kritisch. Solche Studien sind von Natur aus schwieriger durchzuführen, da sie nicht nur genehmigte Anlagen und hoch qualifiziertes Personal erfordern aber auch erhebliche finanzielle Kosten, die abhängig von der Arbeit von Dutzende bis Hunderte von Tausenden von Dollar reichen können. Diese Arten von Studien beinhalten auch eine interdisziplinäre Zusammenarbeit und fachübergreifende Kenntnisse für ihren Abschluss, ihre Komplexität hinzufügen. Daher bietet Ausbildung auf, Entwicklung und Einhaltung ein optimiertes System für die Entnahme von Proben und Erhaltung erhebliche Vorteile für nachgeschaltete molekulare Untersuchungen von Geweben von infizierten Tieren.
Die Sammlung von größeren Lymphknoten präsentiert zusätzliche Herausforderungen für die Gewebe-Sammlung im Vergleich zu ähnlichen Probenahme von murinen Lymphknoten. Die Vorbereitung auf die Probe-Exzision erfordert ein grundlegendes Verständnis der Anatomie des Lymphknotens, einschließlich der relevanten internen Strukturen. Die Struktur eines Lymphknotens besteht aus lymphoiden Läppchen umgeben von Nebenhöhlen mit Lymphe gefüllt. Diese Strukturen sind in eine zähe, fibröse Kapsel eingeschlossen. 4 eine lymphoide Lobule ist die "grundlegende anatomische und funktionelle Einheit des Lymphknotens" und besteht aus Follikel, eine tief kortikale Einheit und medulläre Schnüre und Nebenhöhlen4 (Abbildung 1A). B- und T-Lymphozyten sind Heimat der Follikel und tiefen kortikalen Einheiten. Diese Strukturen bieten eine 3D Gerüst und der Interaktion zwischen Lymphozyten und Antigen oder antigenpräsentierende Zellen.
Grob, Follikel und tiefen kortikalen Einheiten identifiziert werden können auf Schnittfläche als sie eine dichtere netzartige Geflecht enthalten und dunkler als die Nebenhöhlen, die bestehen aus einem zarteren netzartige Geflecht und heller erscheinen (Abbildung 1 b). Gemäß der Konvention beziehen sich Pathologen auf die Regionen der Lymphknoten als oberflächliche Kortex (Follikel), Parakortex (tief kortikalen Einheiten) und der Medulla (medulläre Schnüre und Nebenhöhlen). Eine ordnungsgemäße Untersuchung aller drei Regionen wurde als beste Praxis in Routine pathologischen Untersuchung Leitlinien für Lymphknoten5angesehen. Beachten Sie, dass es erhebliche Unterschiede in der Konsistenz, Größe und Farbe der Lymphknoten, auch innerhalb eines einzelnen Tieres. Zunehmendem Alter der Tiere ihre Lymphknoten wird tendenziell kleiner und werden fester als bei jüngeren Tieren, in der Regel auf eine Erhöhung ihrer Bindegewebe und eine Verminderung der normalen lymphatischen Struktur6,7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg"> Abbildung 1. Anatomie des Lymphknotens. (A) Diese Karikatur zeigt die Anatomie des Lymphknotens, Schlüsselstrukturen darstellt. (B) dieses noch Bild zeigt einen bovinen Lymphknoten schneiden im Querschnitt. Die relevanten Strukturen/Layer, die mit dem bloßen Auge sichtbar sind, werden hervorgehoben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Abhängig von der experimentellen Frage wird verschiedenen Lymphknoten für die Erhebung und Analyse von Interesse sein. Peripheren Lymphknoten sind diejenigen befindet sich tief im subkutanen Gewebe. Bei Rindern, periphere oder oberflächlichen Lymphknoten oft verwendet in der klinischen und experimentellen Praxis umfassen Parotis, mandibulären, retropharyngeal, prescapular, Thymus (precrural) und oberflächlichen inguinalen (Supramammary bei Frauen, bei Männern scrotal) () ( Abbildung 2). In Tabelle 1sind die Eigenschaften der wichtigsten oberflächlichen Lymphknoten, wie beschrieben in die Rinder System8beschrieben. Im folgenden sind einige mögliche Lymphknoten Sammlung Pläne für bakterielle Infektionskrankheiten von Rindern als Ausgangspunkt für die Untersuchung vorgestellt.
Brucella Abortus/Brucella Melitensis: Standard necropsies für B. Abortus-infizierten Rindern und B. Melitensis-infizierten Ziegen am National Animal Disease Center zu erholen, Supramammary, Prescapular und Parotis Lymphknoten Gewebe , sowohl für das Schleifen für die bakterielle Enumeration und für die RNA-Vorbereitung für den Host RNA Ausdruck profilieren. B. Abortus zurückgewonnen werden regelmäßig in jedem der diese Lymphknoten in experimentell infizierten Rindern9. Das Vorhandensein von Bakterien in jedem solcher Lymphknoten nachweisbar in B. Melitensis-infiziert Ziegen bis zu mindestens neun Monate nach der Infektion mit der RNA-basierten Methoden aus unseren Studien (Boggiatto Et Al., unveröffentlicht). Salmonellen SP.: Prescapular, subiliac (Thymus), mesenterialen Lymphknoten nützlich erwiesen haben, während die Profilierung der Rinder Kadaver Salmonellen Prävalenz10,11,12 und wäre von Interesse für transkriptomischen Studien. E. Coli O157: H7: mesenterialen Lymphknoten (in den mittleren Dünndarm und distalen Dünndarm Standorten) sind die Niederlassungen einer gelegentlichen Erholung der Bakterien im infizierten Kälbern (aber nicht bei infizierten Erwachsenen Rindern)13. Leptospirose (Leptospira SP.): eine chronische Persistenz der Bakterien in den Lymphknoten Entwässerung der Brustdrüse14beobachtet worden. Mycobacterium bovis : Bei Rindern wurden die Bakterien wieder Post-experimentelle Infektion von mediastinalen und tracheobronchialer Lymphknoten Kälber15. Darüber hinaus ist Lymphknoten RNA verwendet worden, um große Tier Host Reaktionen auf Viren, wie die Schweine reproduktive und respiratorische Syndrom Virus2zu untersuchen. Abbildung 2 zeigt den Speicherort der eine Teilmenge von diesen großen Lymphknoten im Körper Rinder.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg"> Abbildung 2: Cartoon Darstellung ausgewählter Lymphknoten Standorte in Bos taurus . Die nummerierten Lymphknoten sind kommentiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
In diesem Papier und das zugehörige Video präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung von großen Tieren Lymphknoten für RNA-Studien, soll informativ für Molekularbiologen transkriptomischen Studien von großen Tieren Infektionen beteiligt sein. Erstens bieten wir einen Überblick über die Isolierung-Verfahren für die Lymphknoten mit Probenahme von Rindern und Bisons Gewebe als Beispiele. Gepaart mit dieser Demo, wie im Video dargestellt, ist ein Workflow für eine reproduzierbare Gewebe Probenahme zur RNA-Isolierung. Anschließend beschreiben wir wichtige Überlegungen für die Verarbeitung eines infizierten Lymphknotens mit Fokus auf Sicherheit, Beständigkeit und RNS-Qualität.
Die Vorbereitung der RNA aus dem Gewebe mit einem versauerten Phenol-Guanidin erfolgt Reagenz basiert auf der Originalmethode von Chomczynski und Sacchi16,17, mit einer Reinigung über Silica-basierten Spin Spalten in Anwesenheit von chaotropen Agenten basierend auf der ursprünglichen Arbeit von Vogelstein und Gillespie18. Wir untersuchen auch das Potenzial für die Verwertung von RNA für Transkriptom von Rindern Lymphknoten durch alternative Methoden haltbar gemacht. Schließlich beschäftigen wir die Auswirkungen der Zeitvariablen RNS-Qualität in großen Tier Autopsien, einschließlich eine repräsentativere Experiment Darstellung der Wirkung einer Erhöhung in der Zeit zwischen der Euthanasie und die Probenahme auf dem wiederhergestellten RNA-Profil von Bison und Bovine Lymphknoten. Dieser Artikel wird nicht nur Molekulare Biologen, sondern auch zu tierärztliche Forscher beginnend transkriptomischen Studien nützlich.

<table><tbody><tr><td>RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpels</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps, rat tooth</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td>Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference</td></tr><tr><td>3 mm punch biopsy needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9949469</td><td></td></tr><tr><td>Sharps container (small and transportable for necropsy)</td><td>Stericycle</td><td>8900SA</td><td>1 qt. size shown here</td></tr><tr><td>Cutting boards or disposable trays</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Available in a variety of sizes, depends on user preference</td></tr><tr><td>Personal protective equipment</td><td></td><td></td><td>Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)</td></tr><tr><td>Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>12183018A</td><td>Designed for up to 100 mg tissue</td></tr><tr><td>100% Ethanol (200 proof for molecular biology)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (General, for gel electrophoresis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>1X TBE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24301</td><td>Can also make from scratch in the laboratory</td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>EMD Millipore</td><td>S4117</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer)</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols)</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spreader (L-shaped spreader)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-231</td><td>Only needed for sterility testing for samples from infected animals</td></tr><tr><td>Necropsy knives</td><td>Livestock Concepts</td><td>WI-0009209</td><td></td></tr></tbody></table>

collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species

Große Tiere (Vieh und Wildtiere) dienen als wichtiges Reservoir von Zoonoseerregern, einschließlich Brucella, Mycobacterium Bovis, Salmonellenund Escherichia Coli, und eignen sich für die Untersuchung der Pathogenese und/oder Ausbreitung der Bakterien in natürlichen Wirte. Mit der wichtigen Funktion der Lymphknoten in der Host-Immunantwort dienen Lymphknoten Gewebe als eine potentielle Quelle von RNA für nachgeschaltete transkriptomischen Analysen, um die zeitlichen Veränderungen in der Genexpression in Zellen im Verlauf einer Infektion zu bewerten. Dieser Artikel bietet eine Übersicht über den Prozess der Lymphknoten Sammlung, Gewebe-Sampling und nachgelagerten RNA Verarbeitung in Vieh, weitere Beispiele zur Verfügung gestellt von der amerikanischen Bison (Bison Bison Rind (Bos Taurus) als ein Modell mit ). Das Protokoll enthält Informationen über die Lage, Ermittlung und Entfernung der Lymphknoten aus mehreren wichtigen Standorten im Körper. Darüber hinaus wird eine Biopsie Sampling-Methode vorgestellt, die für eine Konsistenz der Probenahme über mehrere Tiere ermöglicht. Einige Überlegungen zur Probe Erhaltung werden diskutiert, einschließlich der Erzeugung von RNA geeignet für nachgeschaltete Methoden wie RNA-Sequenzierung und RT-PCR. Aufgrund der langen Verzögerungen große Tier vs. Maus Zeitstudien Kurs innewohnt sind repräsentative Ergebnisse von Bisons und Rinder Lymphknoten Gewebe präsentiert um zu beschreiben, den zeitlichen Verlauf der Abbau in diesem Gewebetyp, im Rahmen einer Überprüfung der methodische Vorarbeiten auf RNA-Abbau in anderen Geweben. Insgesamt wird dieses Protokoll sinnvoll, beide tierärztliche Forscher Anfang Transkriptom Projekte auf große Tiere Proben und Molekularbiologen Lerntechniken für in Vivo Gewebe-Probeentnahme und in-vitro- Verarbeitung interessiert sein.

Die Nutzung der in diesem Artikel (Schritte 1 bis 4 des Protokolls) vorgestellten Überlegungen helfen bei der Beitreibung von RNA aus großen Tier Proben, die für eine nachgeschaltete Analyse in Host genexpressionsstudien geeignet ist. Die RNA-Qualität für downstream-Anwendungen wird durch mehrere standard-Maßnahmen beurteilt. Spektrophotometrie A260/a280 Verhältnis liefert ein Maß für die Protein-Verschmutzung und A260/a230 Verhältnis stellt ein weiteres Mittel zur Re...

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Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Erhebung und Verarbeitung von Lymphknoten von großen Tieren für RNA-Analyse: Vorbereitung auf Lymphknoten Transkriptomischen Studien der großen Tierarten

Dieses Protokoll bietet einen Überblick über Verfahren zur Isolierung von RNA für die transkriptomischen Profilierung der Lymphknoten Gewebe von großen Tieren, einschließlich Schritte bei der Identifizierung und Entfernung der Lymphknoten von Vieh und Wildtiere, Probenahme Ansätze Konsistenz über mehrere Tiere, und Überlegungen sowie repräsentative Ergebnisse für die Post-Sammlung, Erhaltung und Verarbeitung für RNA-Analyse zu schaffen.

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.2K Aufrufe.  U.S. Department of Agriculture. Dieses Protokoll bietet einen Überblick über Verfahren zur Isolierung von RNA für die transkriptomischen Profilierung der Lymphknoten Gewebe von großen Tieren, einschließlich Schritte bei der Identifizierung und Entfernung der Lymphknoten von Vieh und Wildtiere, Probenahme Ansätze Konsistenz über mehrere Tiere, und Überlegungen sowie repräsentative Ergebnisse für die Post-Sammlung, Erhaltung und Verarbeitung für RNA-Analyse zu schaffen.

Serie: Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the initiation of an immune response 1. Here, we present methods for adoptive transfer of labeled T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node as first described in 2002 2. Two-photon imaging of immune cells requires that the cells are fluorescently labeled, either by staining with a cell tracker dye or by expressing a fluorescent protein. We demonstrate the adoptive transfer procedure of injecting cells derived from donor mice into the tail vein of a recipient animal, where they home to lymphoid organs within approximately 15-30 min. We illustrate the isolation of a lymph node and describe methods to ensure proper mounting of the excised lymph node. Other considerations such as proper oxygenation of perfused media, temperature, and laser power are discussed. Finally, we present 3D video images of naive CD4+ T cells exhibiting steady state motility at 37&deg;C.

Two-photon imaging has uncovered lymphocyte motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and durring an immune response 1. Here, we demonstrate adoptive transfer of T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node.

Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

Biologie

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and Western Blot, since it mostly contains lipids. RNA isolation from adipose tissue samples is also challenging as extra steps are required to avoid these lipids. Here, we present a procedure to collect three anatomically different white adipose tissues from mice, to process these samples and perform RNA isolation. We further describe the synthesis of cDNA and gene expression experiments using real-time PCR. The hereby described protocol allows the reduction of contamination from the animal's hair and blood on fat pads as well as cross-contamination between different fat pads during tissue collection. It has also been optimized to ensure adequate quantity and quality of the RNA extracted. This protocol can be widely applied to any mouse model where adipose tissue samples are required for routine experiments such as real-time PCR but is not intended for isolation from primary adipocytes cell culture.

The purpose of this paper is to present a step-by-step procedure to collect different white adipose tissues from mice, process the fat samples and extract RNA.

Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Biochemie

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

Die Messung der cytosolischen Ca 2 + In Isolated Kontraktile Lymphgefäße

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine Oberflächliche Lymphknoten Chirurgie

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them immunologically unique. The GI tract and associated MLN are sites of early viral replication in human immunodeficiency virus (HIV) infection and the MLN are likely important reservoir sites that harbor latently-infected cells even after prolonged antiretroviral therapy (ART). The liver has been shown to play a significant role in immune responses to lentiviruses and appears to play a significant role in clearance of virus from circulation. Nonhuman primate (NHP) models for HIV and Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) closely mimic these aspects of HIV infection and serial longitudinal sampling of primary sites of viral replication and the associated immune responses in this model will help to elucidate critical events in infection, pathogenesis, and the impact of various intervention strategies on these events. Current published techniques to sample liver and MLN together involve major surgery and/or necropsy, which limits the ability to investigate these important sites in a serial fashion in the same animal. We have previously described a laparoscopic technique for collection of MLN. Here, we describe a minimally invasive laparoscopic technique for serial longitudinal sampling of liver and MLN through the same two port locations required for the collection of MLN. The use of the same two ports minimizes the impact to the animals as no additional incisions are required. This technique can be used with increased sampling frequency compared to major abdominal surgery and reduces the potential for surgical complications and associated local and systemic inflammatory responses that could complicate interpretation of results. This procedure has potential to facilitate studies involving NHP models while improving animal welfare.

Here, we describe a minimally invasive laparoscopic technique for serial sampling of liver and mesenteric lymph nodes (MLN) in macaques that allows for increased sampling frequency, and reduces the potential for surgical complications when compared to performing a laparotomy.

Die laparoskopische Technik zur Serien Sammlung von Leber und mesenterischen Lymphknoten in Makaken

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Medizin

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important phenomenon in the gut immunity. The stroma of secondary lymphoid organs, such as Peyer&#8217;s patches (PPs) or mesenteric lymph nodes, are where na&#239;ve lymphocytes sense antigens. Na&#239;ve lymphocytes circulate through the bloodstream to reach high endothelial venules, the portal of entry into PPs. Some immunomodulators are estimated to influence lymphocyte migration, but the precise evaluation of microcirculation dynamics is very difficult, and establishing a method to observe lymphocyte migration in vivo can contribute to the clarification of the precise mechanisms. We refined the method of collecting lymphocytes from the lymph duct and observing the detailed dynamics of gut-tropic lymphocytes in rat PPs. We chose confocal laser scanning microscopy to observe rat PPs in vivo and recorded it using time-lapse photography. We can now obtain clear images that can contribute to the analysis of lymphocyte dynamics.

Here, we describe a precise method for collecting thoracic duct lymphocytes and observing the migration of gut-tropic lymphocytes in rat Peyer&#8217;s patches for 3 hours using time-lapse photography. This technique can clarify how the dynamics of lymphocytes are affected under inflammatory conditions.

Mikroskopische Beobachtung der Lymphozytendynamik in Rat Peyers Patches

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...