Gli autori vorrei ringraziare James Fosse per il suo eccellente lavoro su tutti i Videografia ed elaborazione video; Michael Marti per il suo eccellente lavoro nella generazione di immagini digitalizzate bestiame; Lilia Walther per il suo aiuto con estrazione del RNA e Bioanalyzer viene eseguito; Mitch Palmer e Carly Kanipe per la loro recensione utile e feedback sulle immagini di linfonodo; e la cura degli animali e il personale veterinario presso il National Animal Disease Center per tutti i loro duro lavoro e assistenza con la zootecnia e la preparazione per autopsie.

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare. Tutte le ricerche sono finanziata con fondi intramurali da US Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Tutti i riferimenti a specifici prodotti sono forniti ai fini della riproducibilità sperimentale e non rappresentano alcuna approvazione di questi prodotti dal governo federale.

La maggior parte dei studi di trascrittomica e dei relativi protocolli concentrarsi su campioni umani, mouse, ratto o post mortem. Tuttavia, le indagini in bestiame e animali selvatici forniscono una vasta gamma di opportunità per la caratterizzazione della risposta immune alla malattia, sia come applicabile alla medicina veterinaria e, per quanto riguarda le malattie zoonotiche, per la salute umana. Questo protocollo prevedeva un contorno di considerazioni chiave per l'estrazione di RNA ad alta integrità dai tessuti d...

RNA-ordinando l'analisi del trascrittoma di linfonodi offre l'opportunità di caratterizzare la risposta immunitaria degli animali ad una varietà di agenti patogeni. Mentre questa metodologia è stata utilizzata estesamente in topi, analisi recentemente sono state espandendo in più grandi mammiferi1,2. Bestiame/grande animale dei linfonodi può essere utilizzati per caratterizzare la risposta dell'ospite all'infezione, non solo per il loro uso nel vaccino o gli studi di predisposizione genetica e per l'identificazione di bersagli per lo sviluppo di farmaci, ma anche come sistemi modello per studi umani su malattie zoonotiche. Ad esempio, nel caso di brucellosi (una malattia zoonotica batterica che impatti mezzo milione di persone nel mondo ogni anno), nonostante ha aumentato significativamente i costi, gli studi in pecore o capre sono più rilevanti per l'infezione umana e vaccino umano sviluppo di modelli animali di laboratorio. Modelli murini di infezione ricapitolano l'infezione del sistema reticoloendoteliale ma non i segni clinici caratteristici3.
Negli esperimenti sugli animali grandi rispetto agli studi sugli animali di laboratorio, il processo di tessuto raccolta necessariamente comporta un ritardo maggiore tra l'eutanasia e l'insieme del tessuto, che presenta una sfida per la conservazione della RNA di alta qualità. Il RNA intatto è essenziale per la generazione di dati di trascrittomica biologicamente rilevanti. La generazione di RNA di alta qualità da campioni di tessuto è particolarmente critica per gli studi di grande agente patogeno animale condotto in strutture di contenimento. Tali studi sono intrinsecamente più difficili da eseguire come non solo richiedono impianti autorizzati e personale altamente qualificato, ma anche portare significativi costi finanziari, che, a seconda del lavoro, possono variare da decine a centinaia di migliaia di dollari. Questi tipi di studi implicano anche una collaborazione interdisciplinare e conoscenza interdisciplinare per il loro completamento, aggiungendo alla loro complessità. Di conseguenza, formazione, sviluppo di e il rispetto di un sistema semplificato per la raccolta dei campioni e conservazione offre notevoli vantaggi per gli studi molecolari a valle dei tessuti da animali infetti.
La collezione dei linfonodi più grande presenta ulteriori sfide per la raccolta di tessuto rispetto al simile campionamento dei linfonodi murini. La preparazione per l'asportazione di campione richiede una conoscenza di base dell'anatomia del linfonodo, comprese le pertinenti strutture interne. La struttura di un linfonodo è costituita da lobuli linfoidi circondati da seni pieni di linfa. Queste strutture sono racchiuse da una capsula fibrosa, dura. 4 un lobulo linfoide è il "anatomica e funzionale unità base del linfonodo" ed è composto di follicoli, un'unità profonda corticale e cordoni midollari e seni4 (Figura 1A). I linfociti B e T sono sede del follicoli e corticale profonda unità, rispettivamente. Queste strutture forniscono un ponteggio 3D e facilitano l'interazione tra linfociti e cellule presentanti l'antigene o antigene.
Grossolanamente, follicoli e unità profonda corticale può essere identificato sulla superficie di taglio, dato che contengono un denso reticolo reticolare e appaiono più scuri rispetto i seni, che sono costituiti da un reticolo reticolare più delicato e appaiono più chiare (Figura 1B). Per convenzione, i patologi si riferiscono alle regioni dei linfonodi come la corteccia superficiale (follicoli), la paracorteccia (profondità corticale unità) e il midollo (cordoni midollari e seni paranasali). Un esame adeguato di tutte le tre regioni è stato considerato come migliore pratica negli orientamenti per l'esame patologico sistematico per linfonodi5. Nota che c'è una considerevole variazione nella consistenza, dimensione e il colore dei linfonodi, anche all'interno di un singolo animale. Come età animali, loro linfonodi tenderà a diminuire di dimensioni e diventare più forte di quelli degli animali più giovani, in genere a causa di un aumento nel loro tessuto connettivo e una riduzione del normale linfoide struttura6,7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg"> Figura 1. Anatomia del linfonodo. (A) questa immagine del fumetto Mostra l'anatomia del linfonodo, raffiguranti strutture chiave. (B) questo fermo immagine mostra un linfonodo bovino tagliato in sezione trasversale. Sono evidenziati le pertinenti strutture/strati che sono visibili ad occhio nudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
A seconda della domanda sperimentale, vari linfonodi sarà di interesse per la raccolta e l'analisi. Linfonodi periferici sono quelli situati nel tessuto sottocutaneo profondo. Nei bovini, linfonodi periferici o superficiale, spesso utilizzati nella pratica clinica e sperimentale includono parotide, sottomandibolare, retropharyngeal, -prescapolari, prefemorali (precrural) e superficiale inguinale (soprammammari in femmine, scrotale nei maschi) ( Figura 2). In tabella 1, sono descritte le proprietà della chiave linfonodi superficiali, come descritto nel bestiame sistema8. Sotto, alcuni potenziali piani di raccolta di linfonodo per malattie infettive batteriche del bestiame sono presentati come punto di partenza per l'indagine.
Brucella abortus/Brucella melitensis: Standard necropsies per b. abortus-infetti bestiame e b. melitensis-capre infette al National Animal Disease Center recupero tessuto linfonodo parotideo, prescapular e soprammammari , sia per la macinazione per l'enumerazione batterica e per la preparazione di RNA per il delineamento di espressione host RNA. B. abortus possono essere recuperati regolarmente in ciascuno di questi linfonodi in bestiami infettati sperimentalmente9. La presenza di batteri in ognuno di questi tipi di linfonodo può essere rilevata in b. melitensis-infettati capre fino a post-infezione almeno nove mesi, usando le metodologie basate su RNA dai nostri studi (Boggiatto et al., non pubblicato). Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemorali), e i linfonodi mesenterici sono stati utili durante la profilatura delle carcasse di bovini per una prevalenza di Salmonella 10,11,12 e sarebbe di potenziale interesse per gli studi di trascrittomica. Escherichia coli O157: H7: linfonodi mesenterici (a medio piccolo intestino e intestino tenue distale posizioni) possono essere i siti di un recupero occasionale dei batteri in vitelli infetti (ma non in bovini adulti infetti)13. Leptospirosi (Leptospira SP.): una persistenza cronica dei batteri è stata osservata nei linfonodi drenanti la ghiandola mammaria14. Mycobacterium bovis : Nei bovini, i batteri sono stati recuperati di infezione post-sperimentale dai linfonodi mediastinici e tracheobronchial vitelli15. Inoltre, RNA di linfonodo è stato utilizzato per esaminare le risposte di grande animale ospite ai virus, come la sindrome riproduttiva e respiratoria del suino virus2. Figura 2 descrive la posizione di un sottoinsieme di questi linfonodi principali nel corpo del bestiame.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg"> Figura 2: Cartone animato raffigurante località selezionata di linfonodo in Bos taurus . I linfonodi numerati vengono annotati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In questo articolo e il video associato, presentiamo un protocollo per l'isolamento dei linfonodi grandi animali per studi di RNA, progettati per essere informativo per i biologi molecolari coinvolti negli studi di trascrittomica di grandi infezioni degli animali. In primo luogo, forniamo una panoramica della procedura di isolamento per i linfonodi, mediante campionamento dai tessuti bovini e bisonte come esempi. Accoppiato con questa dimostrazione, come mostrato nel video, è un flusso di lavoro per un campione del tessuto riproducibile per isolamento del RNA. Descriveremo inoltre considerazioni importanti per l'elaborazione di un linfonodo infetto, con un focus sulla sicurezza, la coerenza e la qualità di RNA.
La preparazione di RNA dal tessuto con un reagente di isotiocianato di fenolo-guanidina acidificato è basata sul metodo originale di Chomczynski e Sacchi16,17, con una purificazione su colonne di spin a base di silice in presenza di agenti caotropici basati sul lavoro originale di Vogelstein e Gillespie18. Esaminiamo anche il potenziale per il recupero di RNA per trascrittomica dai linfonodi bestiame conservati con metodi alternativi. Infine, abbiamo esplorare l'impatto della variabile tempo sulla qualità di RNA in grande autopsie animali, tra cui un esperimento rappresentanza raffigurante l'effetto di un aumento nel tempo tra l'eutanasia e il campionamento sul profilo del RNA recuperato da bison e bovina nei linfonodi. Questo articolo sarà utile non solo per i biologi molecolari, ma anche a veterinari ricercatori che inizia gli studi di trascrittomica.

<table><tbody><tr><td>RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpels</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps, rat tooth</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td>Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference</td></tr><tr><td>3 mm punch biopsy needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9949469</td><td></td></tr><tr><td>Sharps container (small and transportable for necropsy)</td><td>Stericycle</td><td>8900SA</td><td>1 qt. size shown here</td></tr><tr><td>Cutting boards or disposable trays</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Available in a variety of sizes, depends on user preference</td></tr><tr><td>Personal protective equipment</td><td></td><td></td><td>Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)</td></tr><tr><td>Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>12183018A</td><td>Designed for up to 100 mg tissue</td></tr><tr><td>100% Ethanol (200 proof for molecular biology)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (General, for gel electrophoresis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>1X TBE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24301</td><td>Can also make from scratch in the laboratory</td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>EMD Millipore</td><td>S4117</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer)</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols)</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spreader (L-shaped spreader)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-231</td><td>Only needed for sterility testing for samples from infected animals</td></tr><tr><td>Necropsy knives</td><td>Livestock Concepts</td><td>WI-0009209</td><td></td></tr></tbody></table>

collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species

Grandi animali (bestiame e animali selvatici) servono come importanti serbatoi di agenti patogeni zoonotici, compreso Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaed e. colie sono utili per lo studio della patogenesi e/o diffusione dei batteri negli ospiti naturali. Con la funzione chiave di linfonodi nella risposta immunitaria ospite, linfonodo tessuti servire come una potenziale fonte di RNA per analisi trascrittomica a valle, al fine di valutare i cambiamenti temporali nell'espressione genica in cellule nel corso di un'infezione. Questo articolo presenta una panoramica del processo di raccolta di linfonodo, campioni tissutali e a valle RNA processing in bestiame, usando bovini (Bos taurus) come un modello, con ulteriori esempi forniti dal bisonte americano (bisonte del bisonte di ). Il protocollo comprende le informazioni relative all'ubicazione, identificazione e rimozione dei linfonodi da più siti chiave nel corpo. Inoltre, è presentata una metodologia di prelievo bioptico che consente per una consistenza di campionamento attraverso più animali. Diverse considerazioni per la conservazione del campione sono discusse, compreso la generazione di RNA adatto a valle metodologie come RNA-sequenziamento e RT-PCR. A causa dei lunghi ritardi insiti nella grande animale vs mouse tempo corso di studi, risultati rappresentativi da bison e tessuti bovini linfonodo sono presentati per descrivere il corso di tempo del degrado in questo tipo di tessuto, nel contesto di una revisione del precedenti lavori metodologici sulla degradazione del RNA in altri tessuti. Nel complesso, questo protocollo sarà utile per entrambi ricercatori veterinari inizio transcriptome progetti su grandi campioni di animali e per i biologi molecolari sono interessati ad apprendere tecniche per in vivo campioni tissutali e trattamento in vitro .

L'uso delle considerazioni presentate in questo articolo (passaggi da 1 a 4 del protocollo) sarà di aiuto nel recupero di RNA da grandi campioni di animali che è adatto per un'analisi a valle in studi di espressione genica di host. La qualità di RNA per applicazioni a valle è valutata di più misure standard. Per spettrofotometria, il rapporto di280 A260/A fornisce una misura della contaminazione della proteina ed il rapporto di230 A260/A fornisce un altro mezzo di valutazi...

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Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali

Questo protocollo fornisce una panoramica delle procedure per l'isolamento di RNA per la profilazione di trascrittomica di linfonodo tessuti da grandi animali, compresi i passaggi nell'identificazione e l'asportazione dei linfonodi da bestiame e animali selvatici, approcci di campionamento per garantire la consistenza attraverso più animali e considerazioni più risultati rappresentativi per la conservazione post-raccolta e l'elaborazione per l'analisi del RNA.

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.2K Views.  U.S. Department of Agriculture. Questo protocollo fornisce una panoramica delle procedure per l'isolamento di RNA per la profilazione di trascrittomica di linfonodo tessuti da grandi animali, compresi i passaggi nell'identificazione e l'asportazione dei linfonodi da bestiame e animali selvatici, approcci di campionamento per garantire la consistenza attraverso più animali e considerazioni più risultati rappresentativi per la conservazione post-raccolta e l'elaborazione per l'analisi del RNA.

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Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the initiation of an immune response 1. Here, we present methods for adoptive transfer of labeled T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node as first described in 2002 2. Two-photon imaging of immune cells requires that the cells are fluorescently labeled, either by staining with a cell tracker dye or by expressing a fluorescent protein. We demonstrate the adoptive transfer procedure of injecting cells derived from donor mice into the tail vein of a recipient animal, where they home to lymphoid organs within approximately 15-30 min. We illustrate the isolation of a lymph node and describe methods to ensure proper mounting of the excised lymph node. Other considerations such as proper oxygenation of perfused media, temperature, and laser power are discussed. Finally, we present 3D video images of naive CD4+ T cells exhibiting steady state motility at 37&deg;C.

Two-photon imaging has uncovered lymphocyte motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and durring an immune response 1. Here, we demonstrate adoptive transfer of T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node.

Dissezione e 2-Photon Imaging di linfonodi periferici nei topi

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

Biologia

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and Western Blot, since it mostly contains lipids. RNA isolation from adipose tissue samples is also challenging as extra steps are required to avoid these lipids. Here, we present a procedure to collect three anatomically different white adipose tissues from mice, to process these samples and perform RNA isolation. We further describe the synthesis of cDNA and gene expression experiments using real-time PCR. The hereby described protocol allows the reduction of contamination from the animal's hair and blood on fat pads as well as cross-contamination between different fat pads during tissue collection. It has also been optimized to ensure adequate quantity and quality of the RNA extracted. This protocol can be widely applied to any mouse model where adipose tissue samples are required for routine experiments such as real-time PCR but is not intended for isolation from primary adipocytes cell culture.

The purpose of this paper is to present a step-by-step procedure to collect different white adipose tissues from mice, process the fat samples and extract RNA.

Accumulazione del tessuto adiposo del mouse ed elaborazione per l'analisi del RNA

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Biochimica

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

Misura della Ca citosolico 2 + In isolati Linfatici contrattile

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine superficiale Lymph Chirurgia Node

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identificazione di Coding e classi di RNA Non codificanti espressa in suina sangue intero

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them immunologically unique. The GI tract and associated MLN are sites of early viral replication in human immunodeficiency virus (HIV) infection and the MLN are likely important reservoir sites that harbor latently-infected cells even after prolonged antiretroviral therapy (ART). The liver has been shown to play a significant role in immune responses to lentiviruses and appears to play a significant role in clearance of virus from circulation. Nonhuman primate (NHP) models for HIV and Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) closely mimic these aspects of HIV infection and serial longitudinal sampling of primary sites of viral replication and the associated immune responses in this model will help to elucidate critical events in infection, pathogenesis, and the impact of various intervention strategies on these events. Current published techniques to sample liver and MLN together involve major surgery and/or necropsy, which limits the ability to investigate these important sites in a serial fashion in the same animal. We have previously described a laparoscopic technique for collection of MLN. Here, we describe a minimally invasive laparoscopic technique for serial longitudinal sampling of liver and MLN through the same two port locations required for the collection of MLN. The use of the same two ports minimizes the impact to the animals as no additional incisions are required. This technique can be used with increased sampling frequency compared to major abdominal surgery and reduces the potential for surgical complications and associated local and systemic inflammatory responses that could complicate interpretation of results. This procedure has potential to facilitate studies involving NHP models while improving animal welfare.

Here, we describe a minimally invasive laparoscopic technique for serial sampling of liver and mesenteric lymph nodes (MLN) in macaques that allows for increased sampling frequency, and reduces the potential for surgical complications when compared to performing a laparotomy.

Tecnica laparoscopica per la raccolta di serie del fegato e linfonodi mesenterica in macachi

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Medicina

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Una strategia per lo studio delle cellule linfoidi produttrici di IL-9 nel modello di infezione da Nippostrongylus brasiliensis

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important phenomenon in the gut immunity. The stroma of secondary lymphoid organs, such as Peyer&#8217;s patches (PPs) or mesenteric lymph nodes, are where na&#239;ve lymphocytes sense antigens. Na&#239;ve lymphocytes circulate through the bloodstream to reach high endothelial venules, the portal of entry into PPs. Some immunomodulators are estimated to influence lymphocyte migration, but the precise evaluation of microcirculation dynamics is very difficult, and establishing a method to observe lymphocyte migration in vivo can contribute to the clarification of the precise mechanisms. We refined the method of collecting lymphocytes from the lymph duct and observing the detailed dynamics of gut-tropic lymphocytes in rat PPs. We chose confocal laser scanning microscopy to observe rat PPs in vivo and recorded it using time-lapse photography. We can now obtain clear images that can contribute to the analysis of lymphocyte dynamics.

Here, we describe a precise method for collecting thoracic duct lymphocytes and observing the migration of gut-tropic lymphocytes in rat Peyer&#8217;s patches for 3 hours using time-lapse photography. This technique can clarify how the dynamics of lymphocytes are affected under inflammatory conditions.

Osservazione microscopica della dinamica dei linfociti nelle patch di Rat Peyer

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...