1. Bevor der Prozess vorbereiten und sammeln Sie die folgenden Elemente <ol><li> Bitte beachten Sie das Bild in Abbildung 1a) und 1b) für den Bau einer hölzernen Plattform, um die Maus während des Verfahrens zu beschränken. </li><li> Verdauung Mix für Lymphknoten - HBSS + 1.25mg/ml Collagenase TypIV oder 2,5 mg / ml Collagenase D </li><li> Verdauung Mix für Lungen - HBSS + 1 mg / ml Collagenase </li><li> Verdünnen Latexkügelchen (1:20) in PBS für intraperitoneale Injektion der LDLNs visualisieren </li></ol> Hinweis: LDLNs sind klein und schwer zu finden. Um zu erfahren, wie Sie sie finden, injizieren 200 ul der 1:20 verdünnt rot fluoreszierende Latexkügelchen ip in der Maus. Das Bauchfell Kanalisation, diese LDLNs 8. 24 hpi, setzen die Brusthöhle von der Maus wie oben beschrieben. Die LDLNs wird erscheint rosa von den Perlen, die aus der Bauchhöhle abgeleitet. <ol start="5"><li> Red Blood Cell (RBC) Lysis Buffer - 0,15 NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA in 1L dH 2 0. Der pH-Wert auf 7,2-7,4 und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> 70μm oder 100 um Zellsieb </li><li> Stammlösung von 0,5 M EDTA, pH = 8,0 </li><li> HBSS ohne CaCl 2 und MgCl 2 </li><li> Scheren und stumpfem Ende Zange </li><li> Laryngoskop </li><li> Gavage Nadel (22 Gauge) abgewinkelt (Abb. 2) </li><li> Styropor Kost und Stifte für die Verbreitung der Maus </li><li> Top Waage </li><li> Anilinblau Solution - 10mg/ml in H 2 O </li></ol> Hinweis: Wir werden mit dieser Lösung für die Demonstration der es Injektionstechnik. 2. Herstellung und Anwendung von Maus-Narkose <ol><li> Bereiten Sie eine Mischung aus Xylazin und Ketamin in sterile PBS, so dass die Endkonzentrationen 2mg/ml und 10mg/ml sind jeweils. </li><li> Wiegen Sie die Maus auf eine Top-Waage. </li><li> Berechnen Sie die Dosis für jede Maus erforderlich. Dosis am Xylazin (2-4 mg / kg) und Ketamin (70-80 mg / kg) Körpergewicht durch geeignete Volumen der hergestellten Mischung und injizieren intaperitoneally. Jede Maus-Stamm kann verlangen, Optimierung der Narkose. Mäuse, die zu viel Narkosemittel kann eine verminderte Atemfrequenz, die tödlich sein könnte, nachdem Inokulum in die Lunge instilliert wird. </li><li> Nach 3-5 Minuten, beachten Sie die Maus um die Effekte aus der Narkose. Überprüfen Sie die folgenden Zeichen, um zu bestätigen, dass die Maus vollständig betäubt ist: <ol><li> Die Atemfrequenz verlangsamen sollte. </li><li> Die Maus sollte nicht strecken den Arm, wenn sie durch den Hals griff. </li><li> Es sollte keine Reaktion, wenn die Hinterbeine stimuliert werden. Sind diese Kriterien nicht erfüllt sind, für ein paar Minuten warten und erneut prüfen, bevor Sie den nächsten Schritt. </li></ol></li></ol> 3. Intratracheale Injektion <ol><li> Bereiten Sie das Inokulum in 50 ul Kochsalzlösung. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit einer sterilen Nadel verbogen Magensonde mit dem Inokulum ausgestattet. Die Spritze sollte mit einer 100 &amp;mgr; Luftpolster hinter dem Inokulum geladen werden, um sicherzustellen, dass alle von der Flüssigkeit in der Lunge ist anerzogen. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf den abgewinkelten Holzplattform hängen von seinen Schneidezähnen auf dem Draht und sanft zurückhalten Sie ihn mit einem Stück Band. </li><li> Schalten Sie das Laryngoskop mit der linken Hand (wenn Sie Rechtshänder sind) und greifen ein Paar stumpfe Ende einer Pinzette. Verwenden Sie die Spitze des Laryngoskop und die Zange zu hebeln öffnen Sie den Mund. </li><li> Mit der Zange, ziehen Sie die Zunge heraus und halten Sie sie zur Seite. Führen Sie die Laryngoskopspatel in Richtung der Rückseite des Mundes. Halten Sie das Laryngoskop nach unten sehr vorsichtig in einem 90 ° Winkel gedrückt, bis Sie die Öffnung der Luftröhre zu sehen. Halten Sie das Laryngoskop in Kraft. Vorsicht beim Ziehen der Zunge aus dem Mund, und dies sollte vorsichtig erfolgen, damit keine Gewebeschäden auftritt. </li><li> Mit der anderen Hand nehmen Sie die 1 ml Spritze mit dem Inokulum, mit dem gebogenen Sonde Nadel mit der rechten Hand montiert und die Nadel in die Luftröhre bis zur Biegung der Nadel wird durch den vorderen Schneidezähnen. Drücken Sie den Kolben gleichmäßig auf die Inokulum zu liefern. Das Inokulum sollte nicht Blase. Ziehen Sie die Nadel aus der Luftröhre so schnell wie möglich. Mäuse ersticken und sterben, wenn die Luftröhre zu lange blockiert wird. Halten Sie die Maustaste aufrecht für ein paar Sekunden, bis Inokulum in die Lunge eingeatmet werden. </li><li> Nehmen Sie die Maus aus der Plattform und stellen Sie es in der Nähe einer Wärmelampe. Lassen Sie keine Mäuse unter direkter Hitze für längere Zeit. Die Maus sollte hellwach innerhalb von 30 min nach dem Eingriff (Recovery-Zeit kann auf der Grundlage Stämme variieren). Mäuse fleißig sollte während dieser Zeit beobachtet werden und darf nicht zu heiß oder zu kalt werden, könnte dies auch stellen die Mäuse in Atemnot zum Tod führen. </li></ol> 4. Ernte und Verarbeitung Lung Lymphknoten und die Lunge für die Durchflusszytometrie<ol><li> Sacrifice Mäusen mit der gewünschten Methode sollte nach dem AVMA Euthanasie-Richtlinien. Dies kann je nach individuellen Ernte Ergebnisse. Die Verabreichung einer tödlichen hat der Natrium-Pentobarbital ist ein Beispiel für ein geeignetes Verfahren Euthanasie. Wir haben keine negativen Effekte in der Lunge der Euthanasie von CO 2 zu sehen. </li><li> Pin den Armen und Beinen auf einer Dissektion Bord. Machen Sie einen Schnitt entlang der Mitte der Bauchseite mit einer Schere. Ziehen Sie die Haut und setzen die Brustwand Muskeln. </li><li> Machen Sie Schnitte durch die Brustwand Muskeln, um die Bauchorgane aussetzen. </li><li> Halten Sie die Spitze des Brustbeins mit der Zange und Punktion der Membran. Schneiden Sie die Membran an den Seiten des Brustkorbs. </li><li> Mit der Schere parallel zur Dissektion Plattenoberfläche durch die Brusthöhle entlang der dorso-ventralen Linie auf beiden Seiten abgeschnitten. </li><li> Heben Sie den Brustkorb auf. Auf der rechten Seite des Herzens, etwas unterhalb des Thymus, für zwei Lymphknoten zu suchen. Ein etwas größeres dritten Lymphknoten unter einer kleinen arteriellen Blutgefäße, die senkrecht zu der Luftröhre entfernt. Ernte Lymphknoten in 1 ml der Lymphknoten Verdauung zu mischen. </li><li> Nach der Ernte der Lymphknoten, halten das Herz mit einer Pinzette und greifen die Lungen mit einem anderen. Ernte Lungen in 3 ml eiskaltem PBS in einer 6-Well-Platte. </li><li> Trennen Sie die Lappen der Lunge, absaugen PBS und hacken die Lappen in kleine Stücke mit einer Pinzette und Schere. Add 3ml der Verdauung Mix für Lungen. Halten Sie die 6-Well-Platte auf Eis bei diesem Schritt. </li><li> Inkubieren Sie die Lymphknoten für 25-30 min und Lunge für 30 min bei 37 ° C. Add EDTA zu einer Endkonzentration von 10mM zu jedem der Verdauung Mischungen, die Reaktion und auf Eis zu stoppen. </li><li> Mit einer 3 ml Spritze, pass Stücke von Lunge durch eine 18GA Nadel 3 mal. Mash die Stücke der Lunge und der LNS durch 70-100 um Zelle Siebe mit dem hinteren Ende eines 1ml Spritzenkolben. Waschen Sie die Zelle Siebe mit 10 ml HBSS ohne Ca 2 + und Mg 2 +. Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. </li><li> Das Pellet in 5 ml RBC Lysispuffer und Inkubation für 3 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie 10 ml HBSS ohne Ca 2 + und Mg 2 + zur Lyse zu stillen. Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Rufen Sie die Lunge und LDLN einzelnen Zellsuspensionen bis 10 ml und 5 ml bzw.. Graf lebenden Zellen mit Hilfe eines Hämazytometer durch Trypanblau-Ausschluss. Die Zellen sind nun bereit, für die Durchflusszytometrie Fleck. 1 Lappen der Lunge ausreichend sein für die Durchflusszytometrie. Andere Lappen kann auch für andere experimentelle Fragestellungen innerhalb der gleichen Maus wie Homogenaten für Zytokine oder Gewebe für die Histologie verwendet werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: LDCs und Alveolarmakrophagen in der Lunge zu erwerben Antigen aus dem Alveolarräumen der Lunge unmittelbar darauf folgenden Injektion. Abbildung 3 zeigt den Prozentsatz von CD11c + (ausgedrückt auf LDCs und Alveolarmakrophagen) Zellen, die positiv für fluoreszenzmarkierten Bacillus anthracis Sporen, 30 min post es Injektion. Zu diesem Zeitpunkt hegte ~ 15,9% der CD45 + CD11c + Zellen in der Lunge einzigen Zellsuspension Bacillus anthracis Sporen (Abbildung 3, untere Reihe). Zur weiteren Charakterisierung der CD11c + Zellen in der Lunge, um Kim und Braciale 4 beziehen. Fluoreszenzmarkierten Beads werden routinemäßig eingesetzt zur Bekämpfung von partikulären Antigenen an LDLNs 9 zu bewerten. Zur Beurteilung dieser Transport von der Lunge zu LDLNs wurden fluoreszierende Latexkügelchen mit LPS und LDLNs wurden bei 24 hpi analysiert injiziert. Etwa 4% der CD11c hallo Zellen in der LDLNs hegte fluoreszierende Kügelchen in 24hpi (Abbildung 4). Diese repräsentative Experimente zeigen, dass dieses Protokoll effizient genutzt werden kann, um Zellen, die eingeatmet Partikel Antigene zu erwerben in den Lungen und in der Folge Verkehr sie die LDLNs verfolgen. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Holzplattform für die Fesselung von Mäusen während es Injektion. Ein Holzblock wurde in einem Winkel geschnitten und Metallstangen wurden eingebaut, Vorderansicht Abbildung 1a) und Seitenansicht Bild 1b). Ein kleines Stück Draht um den Metallstab gewickelt, um die vorderen Schneidezähne der Maus zu verankern. Ein Stück Band wurde auf die Plattform rund um die Maus binden, um ihn zu halten, während des Verfahrens angebracht. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Gavage Nadel für ihn Injektion. Eine Magensonde Nadel (rechts) wurde in einem Winkel von ~ 135 ° (links) für ihn Injektion gebogen. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Prozentsatz aller CD11c + Zellen in der Lunge, die es injiziert GFP-exprimierenden Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), 5 Stunden post Challenge Hafen. AJ-Mäuse wurden Herausforderung mit 1x10 8 GFP-Bacillus anthracis Sporen und die Lungen wurden in 5 Stunden nach der Infektion analysiert. Die Dot-Plots zeigen Anteil der CD11c + Lungenzellen, die positiv für Bacillus anthracis sind. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Detektion von fluoreszierenden Kügelchen (gelb / grün) in der Lunge Lymphknoten 24 Stunden nach der i. T Injektion. AJ-Mäuse wurden entweder mit PBS (linkes Bild) oder 5x10 9 Fluoresbrite YG Microspheres (0,5 um) mit 10 ug LPS (rechts) und es LDLNs analysiert 24hpi gegeben wurden. Vertreter Dot-Plots zeigen Anteil der CD11c hallo Zellen in der LDLNs, dass Hafen fluoreszierende Kügelchen gegen einen leeren Kanal aufgezeichnet.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dendritic+cell+subsets+differ+in+their+capacity+to+support+the+induction+of+virus-specific+cytotoxic+CD8++T+cell+responses.">Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses.</a> PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).</li><li>Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dendritic+cell+interaction+dynamics+during+the+induction+of+respiratory+tolerance+and+immunity.">T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity.</a> J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).</li><li>Thomas, R. 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V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).</li></ol>

Wir haben dieses Protokoll genutzt werden, um den Handel mit Bacillus anthracis Sporen aus der Lunge zu den LDLNs studieren. Für ähnliche Anwendungen, sollte die Anzahl der Partikel, die die Lunge sorgfältig ausgewählt werden, so dass das eingespritzte Material in der LDLNs kann mittels Durchflusszytometrie detektiert werden. Wir haben auch erfolgreich diese Methode für adoptiven Transfer von Zellen und die Kennzeichnung von bestimmten Lungen-Zell-Populationen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern eingese...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> 70μm Zelle stariner </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anilinblau </td><td> Fischer </td><td> A967-25 </td><td></td></tr><tr><td> Tierfütterung Nadel </td><td> Popper and Sons Inc </td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase TypIV </td><td> Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Roche </td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite YG Microspheres (0,5 um) </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 17152 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin HCl (100mg/ml) </td><td> Hospira Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laryngoskopspatel </td><td> PennCentury, Inc </td><td> Für Modell LS-1 </td><td> Siehe <a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td> Lightweight Fiber Optik Laryngoskop </td><td> WelchAllyn </td><td> 80814 </td><td></td></tr><tr><td> Red Fluorescent Perlen (0,5 um) </td><td> Invitrogen </td><td> F8812 </td><td> Für ip-Injektion </td></tr><tr><td> Xylazin (100mg/ml) </td><td> Lloyd Laboratories </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry

Phagozytierenden Zellen wie Alveolarmakrophagen und Lunge dendritischen Zellen (LDCs) kontinuierlich Probe Antigene aus dem Alveolarräumen in der Lunge. LDCs, insbesondere, sind dafür bekannt, in die Lunge Lymphknoten (LDLNs), wo sie vorhanden inhalative Antigene an T-Zellen zur Einleitung einer entsprechenden Immunantwort auf eine Vielzahl von Immunogenen 1,2. Migrieren Zur Modellierung Wechselwirkungen zwischen den Lungen und in der Luft-Antigene in Mäusen können Antigene intranasal 1,3,4 verabreicht werden, intratracheal 5 oder als Aerosole 6. Lieferung bis jede Route umfasst verschiedene technische Fähigkeiten und Einschränkungen, die vor der Gestaltung eines Experiments berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel liefert intranasale und Aerosol Exposition Antigene sowohl die Lungen und die oberen Atemwege. Daher Antigene können auf die Nase assoziierten lymphatischen Gewebe (NALT) 7, möglicherweise erschweren die Interpretation der Ergebnisse. Darüber hinaus können beim Schlucken, Niesen und die Atemfrequenz der Maus auch zu Inkonsistenzen in den Dosen geliefert führen. Obwohl die Beteiligung der oberen Atemwege bei einigen Studien bevorzugt werden, kann es die Experimente mit Schwerpunkt auf Veranstaltungen speziell in der Lunge ausgelöst. In dieser Einstellung wird die intratracheale (it) Route vorzuziehen, da sie Testmaterialien liefert direkt in die Lunge und umgeht die NALT. Viele es Injektion Protokolle beinhalten entweder blind Intubation der Luftröhre durch die Mundhöhle oder chirurgische Freilegung der Luftröhre in die Lunge zugreifen. Hier beschreiben wir eine einfache, konsistente, nicht-chirurgische Methode für die es Instillation. Die Öffnung der Luftröhre wird visualisiert mit einem Laryngoskop und eine gebogene Nadel Sonde wird dann direkt in die Luftröhre eingeführt, um die Inokulum zu liefern. Wir beschreiben auch Verfahren für die Ernte und Verarbeitung von LDLNs und Lunge für die Analyse von Antigen Handel mittels Durchflusszytometrie.

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Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Wir illustrieren nicht-chirurgische Lieferung von Testmaterialien in den Lungen von narkotisierten Mäusen über die Luftröhre. Dieses Verfahren ermöglicht die Lunge Exposition gegenüber bakteriellen und viralen Erregern, Zytokine, Antikörper, Perlen, Chemikalien oder Farbstoffe. Wir beschreiben ferner die Ernte und Verarbeitung der Lunge und der Lunge Lymphknoten (LDLNs) für die Durchflusszytometrie.

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

57.0K Aufrufe.  University of Colorado School of Medicine. Wir illustrieren nicht-chirurgische Lieferung von Testmaterialien in den Lungen von narkotisierten Mäusen über die Luftröhre. Dieses Verfahren ermöglicht die Lunge Exposition gegenüber bakteriellen und viralen Erregern, Zytokine, Antikörper, Perlen, Chemikalien oder Farbstoffe. Wir beschreiben ferner die Ernte und Verarbeitung der Lunge und der Lunge Lymphknoten (LDLNs) für die Durchflusszytometrie.

Serie: Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Studieren Wechselwirkungen von<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu identifizieren Lymphozytensubpopulationen in Murine Aorta, Niere und Lymphknoten in einem Modell von Hypertonie

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Erhebung und Verarbeitung von Lymphknoten von großen Tieren für RNA-Analyse: Vorbereitung auf Lymphknoten Transkriptomischen Studien der großen Tierarten

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic findings similar to human acute respiratory distress syndrome (ARDS). The resulting alveolar edema, alveolar-capillary barrier damage, and leukocyte infiltration predominantly affect the left lung, preserving the right lung as an uninjured control and allowing animals to survive. This model of self-limited acute lung injury enables investigation of tissue resolution mechanisms, such as macrophage efferocytosis of apoptotic neutrophils and restitution of alveolar-capillary barrier integrity. This model has helped identify important roles for resolution agonists, including specialized pro-resolving mediators (SPMs), providing a foundation for the development of new therapeutic approaches for patients with ARDS.

Selective intra-bronchial acid instillation to the left lung in mice results in unilateral and self-limited acute lung injury that models human acute respiratory distress syndrome (ARDS) induced by gastric acid aspiration.

Ein Modell der selbstbegrenzten akuten Lungenverletzung durch einseitige Intra-Bronchialsäure-Instillation

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...