Name: visual and microscopic evaluation of streptomyces developmental mutants
Uploaded: 2018-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants at JoVE.com

Die Autoren möchten Otterbein University für Undergraduate Student Forschungsstipendien und Student Research Fund Awards GVK und SGK anerkennen; und das Otterbein Professor Gilbert E. Mills Memorial dotiert Sabbatical Programm Award und den Fachbereich Biologie und Geowissenschaften Fakultät für Wissenschaft und Forschung dotierte Auszeichnung für JAB. GVK und SGK erhielt Bert und Jane Horn ausgestattet Student Research Fund in den Wissenschaften. Die Autoren möchten auch dankbar anerkennen, dass Duquesne University Undergraduate Programm Forschungsstipendien für GVK und SGK finanziert. Ehemalige Juniata College Bachelor Forschungsstudenten, Ryan Johnson und Lindsey Draper trug die Mikroskopie-Bilder für die Abbildungen 2 und 3, bzw..

1. bereiten Sie Instrumente, Kultur, Medien, Lösungen und Petrischalen
<ol><li>Autoklaven Zahnstocher in ein 50 mL Becherglas abgedeckt mit Alufolie, steril zu halten.</li>
	<li>Alle Textilien, die zu sterilisieren (Tipps, Stöcke, Glaswaren, etc.) in einem Autoklaven verwendet. Hinweis: Vorsicht! Befolgen Sie alle Sicherheitshinweise für die Autoklaven-Modell verwendet. Autoklaven stellen ein Risiko für Explosionen und Verbrennungen durch Dampf und Kontakt mit heißen Oberflächen, Materialien und Medien. Aus Sicherheitsgründen Autoklaven zeigen Sie an "Korrekte Verwendung des Autoklaven"34</li>
	<li>
Bereiten Sie die MS Agar (Mannit Soja Mehl (SFM))14 Kulturen wachsen.
	<ol>
<li>1 L Flasche 5 g Sojamehl und 5 g Agar-Agar hinzufügen.</li>
		<li>5 g Mannit in 250 mL Wasser auflösen und in die Flasche mit dem Sojamehl und Agar zu verzichten.</li>
		<li>Fügen Sie ein Schaum Stecker und Folie, um die Öffnung der Flasche und Autoklaven bei 121 ° C, 15 Psi für mindestens 30 min. Achtung: Dieses Medium kocht leicht über. Verwenden Sie eine Flasche, die mindestens viermal das tatsächliche Volumen des MS-Agar wird autoklaviert aufnehmen kann. Ein standard Schnellkochtopf kann anstelle ein Autoklav mit Sicherheit ähnliches verwendet werden. Alternativ kann eine Mikrowelle verwendet werden, um Medien und Materialien zu sterilisieren, ist Zugang zu einem Autoklaven nicht möglich35,36. High-School-Lehrer können auch mit lokalen Hochschulen oder Universitäten autoklaviert liefert Zugang zu zusammenarbeiten möchten.</li>
		<li>Kalte Medien bis komfortabel genug, um zu behandeln. Achten Sie darauf, nicht zu lange kühlen weil Agar bei Temperaturen unter 50 ° C erstarrt.</li>
		<li>Sterile Petrischalen MS Agar aus der Flasche einfüllen, bis der Boden jeder Petrischale etwa die Hälfte ist voll (ca. 25 mL Medien pro Petrischale). Vor der Verwendung von Agarplatten erstarren lassen. Speichern Sie Agarplatten in einem Plastikbeutel bei Raumtemperatur bis benötigt. Hinweis: Agarplatten können auch in einen Kühlschrank gelagert werden, vor allem, wenn Antibiotika in den Medien benötigt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Streak Streptomyces auf Teller für die Vermehrung
<ol><li>Streak Streptomyces Stämme auf MS Agarplatten in einzelnen Kolonien verwenden eine standard-Methode, wie z. B. den Quadranten Streifen Methode wie in Sanders, 201237gezeigt. Hinweis: Eine Impfkeimen Schleife oder sterilen Zahnstocher verwendet werden können. Optional: Andere Medien werden häufig für Streptomyces -Arten, wie R2YE und minimale Medien14verwendet.</li>
	<li>Platten bei 30 ° c inkubieren</li>
	<li>Restreak Platten durch die Auswahl einer einzigen Kolonie alle 4 – 6 Tage. Als Kolonien im Alter werden sie anfällig für zufällige Mutation.</li>
</ol>3. Erstellen Sie Glycerin Myzel Bestände für bakterielle Lagerung
Hinweis: Myzel Aktien können erstellt werden, für alle Streptomyces Stämme, einschließlich Whi Bld Stämme und andere Entwicklungsstörungen Mutanten, die Sporenbildung abschließen können.
<ol><li>15 – 20 Kolonien in 200 – 500 µL 20 % Glycerin mit einer sterilen Holzdübel Applikator mazeriert.</li>
	<li>Übertragen Sie der Brei aus eingelegten Kolonien auf 1,5 mL Gefrierschrank Kultur Rohr, mit einer Mikropipette oder sterilen transferpipette. Hinweis: Die Grundlagen der Mikropipette Nutzung fallen anderswo38.</li>
	<li>Fügen Sie genug 20 % Glycerin machen das Endvolumen 1 mL und vorsichtig mischen. Shop-Proben bei-80 ° C. Hinweis: Vorsicht! Kryo-Sicherheit Handschuhe tragen und einen Laborkittel Haut vor Kontakt mit extremer Kälte zu schützen. Alternativ kann ein-20 ° C-Gefrierschrank mit möglichen Rückgang der langfristigen Lagerzeit verwendet werden. Vermeiden Sie übermäßige Einfrieren und Auftauen um Rentabilität zu verlängern.</li>
</ol>4. Erstellen Sie Glycerin Spore Bestände für Stämme in der Lage, Sporenbildung
Hinweis: Spore Bestände sind vorzugsweise für langfristige Rentabilität aber nur machbar für Stämme, die Sporenbildung zu vollenden können.
<ol><li>
Verteilen Sie 100 µL des eingelegten Materials (aus Schritt 3.1) auf einer nährbodenplatte konfluierende Rasen Wachstum37zu erhalten. Hinweis: Ausbreitung Beschichtung zeigt sich in Sanders37 (Änderung: eine Drehscheibe ist nicht erforderlich.). Die Platte mit einer Hand drehbar während mit der anderen Hand den Streuer in einem sanften hin und her bewegen Bewegung über die Agar-Medien.<ol>
<li>Pipettieren 100 µL der eingelegten Myzel in die Mitte eines MS-Agar-Platte.</li>
		<li>Sterilisieren Sie ein Glas oder Metall Tool durch teilweise Eintauchen in 70 % igem Ethanol und übergeben den Streuer einmal langsam durch einen Bunsenbrenner Flamme zu beschleunigen die Verdunstung des Ethanols zu verbreiten. Achtung: Ethanol ist leicht entzündlich. Legen Sie den flammenden Streuer in Ethanol nicht oder erlauben Sie die brennenden Tropfen von Ethanol in der Ethanol-Schale fallen. Alternativ verwenden Sie eine Einweg-sterilen Wattetupfer, um die Bakterien auf der Platte verteilt, keine Ethanol- oder Flamme erfordert.</li>
		<li>Biegen Sie die MS-Agar Platte mit einer Hand, während mit einer Rückseite und her Bewegung die Platte mit der sterilen Streuer zu impfen.</li>
		<li>5 – 7 Tage bei 30 ° C inkubieren Sie, bis der Stamm gut sporulated ist. Hinweis: Die Inkubationszeiten variiert je nach Art und Sorte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL steriler Kochsalzlösung (0,8 % NaCl) in die Mitte eines konfluierende Rasens von Streptomyces -Zellen, die Sporenbildung durchgemacht hat.</li>
	<li>Ernten Sie Sporen durch leichtes reiben die Oberfläche des Mycels mit einem sterilen impfen Schleife (oder ein Wattestäbchen), langsam bewegten gegen den Rand des Rasens.</li>
	<li>Pipettieren der saline mit Sporen in einem 15 mL konische Röhrchen. Vortex kräftig zu Spore Ketten in einzelne Zellen zu sprengen.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur für 5 min bei ca. 2.500 X gZentrifugieren.</li>
	<li>Pipettieren der überstand und entsorgen. Die Spore-Pellet durch kräftige Wirbel Agitation in der kleinen Menge der verbleibenden Flüssigkeit zu zerstreuen.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie die Sporen in 1 mL 20 % Glycerin durch zeichnen die Lösung oben und unten mit einer Pipette.</li>
	<li>Übertragen Sie die Glycerin-Spore-Aktie auf ein 1,5 mL Gefrierschrank Rohr. Shop bei-80 ° C. Achtung: Kryo-Sicherheit Handschuhe tragen und einen Laborkittel Haut vor Kontakt mit extremer Kälte zu schützen. Alternativ kann ein-20 ° C-Gefrierschrank mit möglichen Rückgang der Rentabilität langfristig Lagerzeit verwendet werden. Vermeiden Sie übermäßige Einfrieren und Auftauen um Rentabilität zu verlängern.</li>
</ol>5. führen Sie Mutagenese
<ol><li>Führen Sie Mutagenese anhand der gewünschten Ergebnisse wie in der Einführung verwiesen und vor kurzem von Baltz, 201639überprüft. Hinweis: Einige Phänotypisierung Experimente benötigen keine Mutagenese, wie die Absicht, neue Arten aus der Umwelt zu identifizieren. Methoden der zufällige Mutagenese umfassen die Verwendung von ein Transposon8,9,10,11,12,13, UV-Strahlung oder Chemikalien14. Site-verwiesene Mutagenese15,16,17,18,19,20 Techniken können verwendet werden, um spezifische Punktmutationen, Deletionen, erstellen oder andere Arten von Mutationen.</li>
</ol>6. vergleichen Sie und zeichnen Sie das visuelle Erscheinungsbild
<ol><li>Beachten Sie Kolonie Morphologie für jede Mutante im Vergleich zu Wildtyp Elternstamm nach Streifen alle Stämme wie in Schritt 2. Vergleichen Sie das neue Isolat, dass eine gut untersuchten Arten, wie S. Coelicolor oder S. Venezuelae, wenn neue Streptomyces -Arten zu charakterisieren. Beachten Sie die Eigenschaften (Abbildung 1) wie Grundform, Oberfläche der Kolonie (fuzzy, Kahl, Faltig, etc.), Deckkraft, Höhen- und Pigmentierung (unterscheiden zwischen vegetativen Myzel, Antenne Myzel und/oder umgebende Medium).</li>
	<li>Beschriften Sie eine MS-Agar Platte und Streak Wildtyp und Mutanten Stämme in Keil Muster (Abbildung 1). Es ist darauf zu achten, dass keine Belastung eine andere Belastung berührt um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Beachten Sie das Datum und die Uhrzeit, die Stämme auf den Teller durchzogen sind. Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C.</li>
	<li>Ort gewachsen Petrischalen auf farbigen oder weißen Papier Hintergrund zu homogenisieren. Schreiben Sie auf Papier der Stamm-Name, Datum, Inkubationstemperatur und Zeit von der ersten Platte Streifen. Nehmen Sie digitale Bilder der Platte mit den letzten Informationen auf dem Papierhintergrund geschrieben, so dass Verwirrung minimiert wird. Hinweis: Das Schreiben kann beschnitten werden aus der Fotografie zu einem späteren Zeitpunkt soll es für Abbildung Vorbereitung verwendet werden.</li>
</ol>7. führen Sie Phasenkontrast-Mikroskopie
<ol><li>Sterilisieren Sie Pinzette durch Waschen in 70 % igem Ethanol und dann durch einen Bunsenbrenner Flamme das Äthanol verdunsten. Abkühlen lassen.</li>
	<li>Sterilisieren Sie Deckgläsern, indem Sie in 70 % igem Ethanol zu waschen und dann in eine sterile Petrischale trocknen lassen.</li>
	<li>
Bereiten Sie einen Deckglas Aufzug des Bakterienwachstums untersucht werden.
	<ol>
<li>Eine sterile Deckglas mit einer sterilen Pinzette holen Sie ab und das Deckglas auf einer nährbodenplatte MS wo ist Bakterienwachstum dicht. Drücken Sie auf der Rückseite des Deckglases vorsichtig mit einer Pinzette um ausreichend Transfer von Bakteriensporen und Antenne Myzel sicherzustellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das Deckglas aus der Platte holen Sie und platzieren Sie, so dass die Seite mit das Zellmaterial in Richtung der Oberfläche einen Objektträger mit einem 15 µL Tropfen 50 % Glycerin im Wasser für die Montage vorbereitet zeigt. Reduzieren Sie Luftblasen, indem man das Deckglas in einem 45°-Winkel zur Folie und lassen Sie es auf 50 % Glycerin.</li>
	<li>(Optional) Dichtung mit klaren Nagellack für die Erhaltung der Folie.</li>
	<li>
Durchführen Sie Phasenkontrast-Mikroskopie wie in verschiedenen Zeitabständen während die Lebenszyklen von fröhlich40 beschrieben. Hinweis: Wiederholte Bildgebung ermöglicht eine umfassendere Analyse und die Fähigkeit zu Verzögerungen in der Entwicklung zu erkennen. Wiederholen Sie selbstständig die Beobachtungen, um Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.<ol>
<li>Legen Sie die vorbereitete Folie auf den Mikroskoptisch und Tropfen Sie einen Immersionsöl auf der Mitte des Deckglases. Drehen Sie die 100 X Phase Ziel in platzieren, und legen den Kondensator-Turm auf die richtige Phaseneinstellung für "passende. Das Bild mit nur der Feinjustierung Regler einmal die Objektivlinse in Kontakt mit dem Öl zu konzentrieren.</li>
		<li>Untersuchen Sie verschiedene Gesichtsfelder zu erkennen, deutliche und konsistente Unterschiede zwischen mutierte Stämme und dem Wildtyp, wie die Fähigkeit, Sporen, Spore Größe und Form und Zahl der Sporen (siehe Abbildung 2). Hinweis: Alternativen zur Phasenkontrast-Mikroskopie sind differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie40 und einfache befleckenden Techniken, um mit Hellfeld Mikroskope41, wie Kristallviolett Verfärbungen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. führen Sie die Fluoreszenz-Mikroskopie
<ol><li>Pinzette durch Waschen in 70 % igem Ethanol und laufen dann durch einen Bunsenbrenner-Flamme zu sterilisieren.</li>
	<li>Holen Sie eine sterile Deckglas mit sterilen Pinzette und Platz auf einer MS nährbodenplatte wo Bakterienwachstum offensichtlich ist. Tippen Sie auf die zurück das Deckglas vorsichtig mit der Pinzette um ausreichend Transfer von Bakteriensporen und Antenne Filamente zu gewährleisten.</li>
	<li>Das Deckglas aus der Platte holen Sie ab und platzieren Sie, so dass die Seite mit dem Zellmaterial, auf Karton zur einfachen Manipulation von dem Deckglas gegenübersteht.</li>
	<li>Überschwemmen Sie das Deckglas mit eiskalten Methanol (~ 300 µL für ein 20 x 20 mm2 Deckglas) und lassen Sie komplett Lufttrocknen. Achtung: Methanol ist ein Mutagen. Vermeiden Sie direkten Hautkontakt.</li>
	<li>Waschen Sie das Deckglas dreimal Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)42 vorsichtig Dosieren und entfernen die Lösung.</li>
	<li>Fügen Sie 15 µL von 100 μg/ml Propidium Jodid und/oder 10 μg/mL Weizen-Keim-Agglutinin konjugiert zu Fluorescein erfolgt (WGA-FITC) in 50 % Glycerin gemacht, um einen beschrifteten Objektträger. Hinweis: Propidium Jodid DNA Flecken rot, chromosomale DNA Lage zu erkennen, während WGA-FITC Zellwand grüne Flecken.</li>
	<li>Deckglas Gesicht nach unten auf den Tropfen fluoreszierende Fleck auf den Objektträger zu invertieren. (Optional) mit klaren Nagellack für die Erhaltung der Folie abdichten.  Da die Farbstoffe lichtempfindlich sind, 15 Minuten in einem abgedunkelten oder schwach beleuchteten Raum inkubieren.</li>
	<li>Beobachten Sie die Folien unter ein 100 X Objektiv mit einem Phasen-Kontrast oder DIC Mikroskop ausgestattet mit Epifluoreszenz Erregung Würfel für Propidium Jodid ("Texas Red" Filter setzen oder 535/617 nm Anregung/Emission Maxima) und FITC (FITC filter Set oder 490/525 nm Anregung/Emission Maxima).</li>
	<li>Legen Sie die Folie, auf der Bühne und Fokus mit den groben und feinen Einstellknöpfen.</li>
	<li>Beobachten Sie die Fluoreszenz wie anderswo43gezeigt.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Kostenloses Bild Analyse-Software-Paket, die bei der Identifizierung von Sporen mit niedrigeren Fluoreszenz Intensität44helfen können.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier präsentieren wir Protokolle für den Beginn von Streptomyces Forscher um Studien zu initiieren, indem unter anderem die notwendigen Schritte zur Stämme zu propagieren und vorzubereiten Bestände für die langfristige Lagerung. Dann beschreiben wir die Protokolle für visuelle und mikroskopische Charakterisierung von Streptomyces Stämme. Einige typische erste Schritte in Phänotypisierung Entwicklungsstörungen Mutanten sind: 1) Sichtprüfung der Mutanten Kolonien im Vergleich zu Wildtyp-Kolonien auf Agar Medium; (2) Phasenkontrast-Mikroskopie; und 3) Fluoreszenz-Mikroskopie von sporogenes Antenne Hyphen. Basierend auf den Phänotyp in diesen drei Schritten angezeigt, kann eine Vielzahl von Techniken eingesetzt werden, um weiter den Phänotyp eines bestimmten Stammes zu erkennen.
Anfängliche Phänotypisierung Experimente sind häufig verwendet, um neue Arten zu charakterisieren, Mutanten von Interesse zu identifizieren, teilweise Mutanten zu charakterisieren und beginnen zu erkennen, die typische Rolle eines bestimmten Gens, basierend auf den Phänotyp einer identifizierten mutierte. Die hier beschriebenen Methoden wurden bereits eingesetzt, in der universitären Lehre Labors zu identifizieren und zu charakterisieren eine Vielzahl von Streptomyces Mutanten, einschließlich derjenigen mit defekten Zellteilung48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54, Sporenbildung55,56, Antenne Myzel Bildung57,58, antibiotischen Produktion59, second Messenger Signalisierung47und Chromosom segregation 60. diese Techniken sind wichtige erste Schritte zur Bestimmung des Phänotyps der Mutanten im allgemeinen und zeigen eine große Menge von wichtigen Informationen über die Rolle der Gene von Interesse. Die Methoden können leicht auf andere Arten von Streptomyces verlängert werden und bereits verwendet wurden, um die Stämme von S. früh, S. Venezuelae, S. Krätzeund vielen anderen Streptomyceten beschreiben. Die hier beschriebenen Videoprotokolle sollen als eine wichtige Ressource für neue Forscher Eingabe Streptomyces Forschungsgebiete, wie z. B. im Bereich der Arzneimittelforschung dienen. Dazu gehören der neue Lehrer, die gegen die Antibiotika-Resistenz-Krise und die zahllosen neuen Bachelor-Student Forscher verbinden die Crowdsourcing-Bemühungen der kleinen Welt Initiative Erziehung tätig sind.
Die hier beschriebenen Techniken können College und High School Verwendung im Unterricht neben Forschungslabors, mit den Änderungen in der Video und Text beschrieben leicht angepasst. Studenten in einem ersten Jahr Mikroskopie-Modul an eine kleine liberale Kunsthochschule durften Streifen Stämme, digital fotografieren von Stämmen auf Agar Medien gewachsen und durchführen Phasen-Kontrast und Fluoreszenz-Mikroskopie, kulminierte in der Vorlage eine Portfolio von Multi-getäfelten Zahlen am Ende des Moduls 3 Woche, 15 h im Labor Arbeit darstellt. Ca. 160 Studenten im erste Studienjahr sorgten für die ersten Phänotypisierung von 320 Roman Transposon-Mutanten. Bachelor Forschungsstudenten an drei Hochschulen nahmen an der ersten Phänotypisierung von zusätzlichen Mutanten und die anschließende Charakterisierung vieler Stämme. Die umfassenden Daten in relativ kurzer Zeit, zeigen den Wert der hier beschriebenen Protokolle. Hunderte von zusätzlichen Mutanten wurden als Glycerin Myzel Bestände für zukünftige Charakterisierung gespeichert.
Im Anschluss an die erste Experimente hier beschrieben kann eine Vielzahl von Methoden eingesetzt werden, um die Qualität der Informationen im Zusammenhang mit Belastungen von Interesse zu verlängern. Wenn die Mutation nicht bekannt ist, sollte eine Genotypisierung-Methode eingesetzt werden, bestimmen die Art und/oder Ort der Mutation. Z. B. zufällige Transposon Mutagenese der Wildtyp Chromosom6,7,8,9,10,11,12,13 ergibt sich in Kolonien, die phänotypische Einstiegsbilder wie beschrieben oben unterzogen werden soll. Dann sollte die Position des das Transposon mit einer Technik wie inverse Polymerase Kettenreaktion (iPCR)61identifiziert werden. Bestimmung des Genotyps des neu entdeckten Mutanten ist ein wichtiger Schritt nach anfänglichen Charakterisierung.
Einige häufig verwendeten fortschrittliche Methoden für nachfolgende Phänotypisierung Analyse, die möglicherweise im Unterricht erwähnt oder durch weitere Forschung erforscht sind grünes fluoreszierendes Protein (GFP) tagging um Lokalisierung Muster für das Protein des Interesses festzustellen, Genexpressionsanalysen wie Real time quantitative PCR (qPCR) und global Gen Expressionsmuster von Wildtyp versus Mutante über RNA Sequenzierung (RNA-Seq). Phänotypisierung Fähigkeiten sind auch für die Ergänzung der genetischen Analyse erforderlich. In einem Experiment Ergänzung wird die Wildtyp Kopie eines Gens eingeführt, in einen mutierten Stamm zu bestimmen, ob das neu hinzugefügte Allel für den Verlust der Funktion des mutierten Allels kompensieren kann. Vergleicht man den Phänotyp der ergänzt Belastung derjenigen der ursprünglichen Mutant und der Elternzeit, ist Wildtyp Stamm erforderlich.

Streptomyceten sind Gram-positive, filamentösen Bodenbakterien, die bekannt für ihre Fähigkeit, eine Vielzahl von Sekundärmetaboliten, einschließlich mehr als zwei Drittel der im Handel erhältlichen Antibiotika, sowie als Anti-Tumor, produzieren Anti-HIV- und Anti-Parasiten-Medikamente 1. S. Coelicolor ist das am meisten genetisch geprägten Mitglied der Gattung2,3 und ist die Art in die hier beschriebenen Methoden verwendet. S. Coelicolor hat einen komplexen Lebenszyklus, der mit Keimen von einem einzigen Spore beginnt voran, eine umfangreiche, verzweigten vegetativen Myzel, das in das Agar-Medium wächst. Im weiteren Verlauf des Lebenszyklus entstehen Antenne Filamente, die brechen die Oberflächenspannung des Mycels Substrat und gliedern sich schließlich in langen Ketten von Zellen, die letztlich in Reife, grau pigmentierte Sporen umgewandelt werden. Dispersion von dieser neu gebildeten Sporen bildet den Anfang der nächsten Lebenszyklus4.
Aufgrund seiner komplexen Muster der Differenzierung dient S. Coelicolor als ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der bakteriellen Entwicklung. In der Vergangenheit Mutationen produzieren unterschiedliche visuelle Phänotypen und Blöcke für zwei wichtige Phasen der Entwicklung führen. Die Bld (Kahl) Mutanten sind für Luftaufnahmen Myzel Bildung und Ergebnis in dem Mangel einer fuzzy Antenne Myzel vermitteln eine "bald" Kolonie aussehen gesperrt. Mutanten in Sporenbildung gehemmt und Reifung werden als Whi (weiß) Mutanten bezeichnet weil sie nicht in der Regel Wildtyp Ebenen der grauen Spore-Pigmente zu produzieren und die Antenne Myzel bleibt weiß. Andere interessanteren Mutanten sind in der antibiotischen Produktion, Zellteilung, Chromosom Abtrennung oder andere wichtige Prozesse4,5gehemmt.
Trotz der Entdeckung der vielen entwicklungsgenen in Streptomyces -Arten es gibt viele mehr geglaubt, um existieren basierend auf das Fehlen der Sättigung der mutierten Bildschirme. Unsere Laboratorien weiterhin identifizieren neue entwicklungsgenen mit einer Mini-Transposon-System, die wir aufgebaut haben. Neuartige mutierte Stämme isoliert in zufällige Mutagenese-Experimente mit unserem Transposon unterziehen phänotypische Screening um die mögliche Rolle von jeder neuen gen entdeckt6,7zu identifizieren. Die Methoden zur bakteriellen Phänotypisierung hier beschriebenen sind für Streptomyces Mutanten isoliert durch Transposon Mutagenese8,9,10,11,12relevant, 13 und andere zufällige Methoden, wie chemische und Ultraviolett (UV) Mutagenese14sowie die gerichtete Konstruktion von Mutationen wie gen-Deletionen mit Restriktionsenzymen15,16 oder CRISPR-Cas9 (gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt) Genom Bearbeitung Technologie17,18,19 und Punktmutationen20.
Während Antibiotika-Resistenzen bei Krankheitserregern zunehmend verbreitet wird, wird der Bedarf an neuen Antibiotika immer dringender21,22. Die "Initiative kleine Welt" (oder SWI) ist eine effektive Wissenschaft, Technik und Mathematik (STEM) lernen23 und Forschung Strategie24 zur Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen durch Crowdsourcing von College-Studenten und vieles mehr vor kurzem Schülerinnen und Schüler. Unterstützte Kurse Arbeit umfasst die Identifizierung neuer Bodenmikroben, die neuartige Antibiotika (http://www.smallworldinitiative.org) zu produzieren. Es wird vermutet, dass eine wichtige Quelle von unentdeckten Antibiotika weiterhin Streptomyces -Arten gefunden in einer Vielzahl von Boden und Wasser Lebensräume25,26,27,28, 29,31. Vor kurzem, haben unser Labor und die Arbeit der anderen entdeckt und charakterisiert Signalisierung Gene in Streptomyces -Arten, die Morphologie und Entwicklung, einschließlich der antibiotischen Produktion7,32zu regulieren, 33. Veränderungen in der Expression dieser Gene führen zu Änderungen in der Höhe und Zeitpunkt von Antibiotika produziert. Qualifizierte Phänotypisierung von neuen Arten und neuen Antibiotika produzierenden Mutanten werden weiterhin wichtig sein. Neue Lehrer und ihre Schüler maßgeblich auf dem Gebiet der Arzneimittelforschung werden, ist die Ausbildung in bakteriellen Phänotypisierung notwendig für den Erfolg dieser unerfahrene Personen. Darüber hinaus sind diese Experimente für High School Stamm oder Mikrobiologie Bildung Universitätslabors steuerbar. Sie repräsentieren eine Demonstration der mikrobiellen genetischen Grundlagen in ein Lehrlabor einstellen.

<table><tbody><tr><td>50% Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil (Type DF)</td><td>Cragille&amp;nbsp;</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>Lens Paper</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-1L</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Toothpicks (flat)</td><td>Target</td><td>081-22-1957</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (10 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (200 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-200Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (1,250 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-1250</td><td></td></tr><tr><td>Wooden Applicators 6&#039;&#039;</td><td>Solon Care</td><td>070809</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour&amp;nbsp;</td><td>Bob&#039;s Red Mill&amp;nbsp;</td><td>1516C164</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 100%</td><td>VWR amresco life science&amp;nbsp;</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>0.8% NaCl (Saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9000V</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mL freezer tube</td><td>NEST</td><td>606101</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low (-80 &amp;deg;C) freezer</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Safety Gloves</td><td>Bel-Art</td><td>H13201</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips #1.5</td><td>Thomas Scientific</td><td>64-0721</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Carolina</td><td>63-2010</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540E</td><td></td></tr><tr><td>Phase-Contrast Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>BX40</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Carolina Biological</td><td>624504</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Carolina Biological</td><td>706706</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffer saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Biotium</td><td>29022-1</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>OPI</td><td>22001009000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Free Software</td><td></td></tr><tr><td>100 mL beaker</td><td>Pyrex USA</td><td>1000-T</td><td></td></tr><tr><td>1 L beaker</td><td>Carolina Biological</td><td>721253</td><td></td></tr><tr><td>1 L flask</td><td>Fisherbrand</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 mL flask</td><td>Pyrex USA</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>100 mL graduated cylinder</td><td>Carolina Biological</td><td>721788</td><td></td></tr><tr><td>500 mL graduated cylinder&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological</td><td>721792</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-271825</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Camera for Microscope</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Examination Gloves (Med)</td><td>Bio Excell</td><td>71011002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Carolina Biological</td><td>701077</td><td></td></tr></tbody></table>

visual and microscopic evaluation of streptomyces developmental mutants

Streptomyceten sind filamentösen Bodenbakterien, Phylum Actinobacteria angehören, die findet man überall in der Welt und produzieren eine breite Palette von Antibiotika und anderen sekundären Pflanzenstoffen. Streptomyces Coelicolor ist ein gut-gekennzeichneten, nicht-pathogene Arten, die für eine Vielzahl von Analysen im Labor zugänglich ist. Die Phänotypisierung beschriebenen Methoden verwenden hier S. Coelicolor als ein Modell Streptomycete; die Methoden sind jedoch auf alle Mitglieder dieser großen Gattung sowie einige eng verwandten aktinomyceten anwendbar. Phänotypisierung ist notwendig, um neue Arten von Streptomyces identifiziert in der Umwelt zu charakterisieren, und es ist auch ein erster wichtiger Schritt bei der Charakterisierung neu isolierten mutierte Stämme von Streptomyces. Kenntnisse in Phänotypisierung ist wichtig für viele neue Forscher, die das Forschungsgebiet Streptomyces eingeben umfasst die Untersuchung der bakteriellen Entwicklung, Zellteilung, Chromosom Abtrennung und zweite Bote Signalisierung. Die jüngsten Crowdsourcing antibiotische Entdeckung durch die Isolierung der neuen Bodenmikroben hat einen erhöhten Bedarf an Training in Phänotypisierung für Instruktoren, die neu auf dem Gebiet von Streptomyces -Forschung und ihrer Hochschule oder High School Studenten geführt. Dieses Manuskript beschreibt Methoden für Bakterienstamm Verteilung, Lagerung und Charakterisierung durch visuelle und mikroskopische Untersuchung. Nach der Lektüre dieses Artikels sollten neue Forscher (Mikrobiologie Bildung Laboratorien und Bürger Wissenschaftler) möglicherweise manipulieren Streptomyces Stämme und visuelle Charakterisierung Experimente beginnen.

Anfängliche Phänotypisierung Experimente sind notwendig für die Charakterisierung von neuen Arten und Stämme und können als ein kostenloses Ansatz bei der Phylogenetik und DNA-DNA-Hybridisierung-Experimente, die verwendet werden, für die Charakterisierung von neuen Arten verwendet werden. Streptomyces Mutanten aus zufälligen Mutagenese Methoden wie Chemie, UV, oder Transposon Mutagenese sind in der Regel durch direkten, visuellen Bildschirme auf Agarplatten identifiziert. Kolonien von Streptomyces werden auf Veränderungen im Phänotyp im Vergleich zu Wildtyp, elterliche Belastung untersucht. Zum Beispiel eine leichtere farbigen Luftaufnahme Myzel deutet auf ein geringeres Maß an grauen Pigment, verursacht durch einen Defekt in Sporenbildung, oder das Fehlen von unscharf aussehen ist bezeichnend für einen Block in Antenne Myzel-Formation (Abbildung 1). Viele verschiedenen produzieren pigmentierten Antibiotika im vegetativen Myzel oder umliegenden Agar. S. Coelicolor produziert zwei pigmentierte Antibiotika sowie zwei nicht pigmentiert sind. Actinorhodin ist ein blau-pigmentiert Antibiotikum und Undecylprodigiosin ist ein rot pigmentiert Antibiotika-45. Stämme, die erste visuelle Kolonie Bildschirme durchlaufen haben sind dann Streifen für die einzelnen Kolonien propagierten.
Stämme werden nach visuellen Identifikation potentiell interessante Mutanten mikroskopische Untersuchung unterzogen. Phasenkontrast-Mikroskopie eignet sich besonders zur Untersuchung von Streptomyces Mutanten für Entwicklungsschäden, unter Verwendung den Wildtyp Stamm als ein Steuerelement (Abbildung 2). Wildtyp S. Coelicolor Kolonien produzieren in der Regel eine Antenne Myzel von etwa zwei Tagen Wachstum bei 30 ° C auf MS Agar und lange Ketten von Sporen durch drei Tage des Wachstums. Der Lebenszyklus wird etwas langsamer oder schneller auf andere Arten von Medien Fortschritt. Es ist zwingend notwendig, dass die Mutanten unter der gleichen Wachstumsbedingungen als der Wildtyp analysiert werden, wenn Sie Rückschlüsse auf die Entwicklungsschäden und Verzögerungen zu zeichnen. Glatze Mutanten können Sporen nach längerem Wachstum auf Agar Medien produzieren. Eine Klasse von Mutanten, die als weiße Mutanten entweder für die Sporenbildung, verzögert werden können zeigen eine Reduktion in der Fülle von Sporen produziert, produzieren Sporen mit Form und/oder Größe Mängel oder einfach Produkte niedrigeren Ebenen der Reife, graue Spore Pigment46 . Anderen Mutanten untersucht so weit sein verzögert oder beschleunigt in der Life-Cycle-Progression wie die Mutanten, die für die Akkumulation von Signalmoleküle (z.B. zyklische di GMP47) betroffen.
Einfach anschließt an die Lichtmikroskopie-Technik, die oben beschriebenen Fluoreszenz-Mikroskopie mit Propidium Jodid Fleck chromosomale DNA ausgedehnt und Gewebekulturen beschrifteten Weizenkeime Agglutinin, um die Zellwand der Sporenbildung Septen zu beflecken. Fehlt ein Chromosom Sporen werden frei von den roten Propidium Jodid Färbung, während die Sporen, die enthalten weniger DNA als übliche identifiziert werden kann, erscheint sie abgenommen haben (Abbildung 3) Färbung. Wheat Germ Agglutinin kann verwendet werden, um die Zellwand zu beflecken und Unterschiede in der Zellwand Muster (d.h. Zellteilung Mängel) Färbung beobachtet werden können. In Abbildung 4 der Wildtyp-Stamm von S. Venezuelae, eine Spezies, die vor kurzem als ein anderes Modell verwendet wird hat Streptomycete wegen seiner schneller Lebenszyklus und Fähigkeit, in flüssigem45, sporulate mit WGA-FITC aufzuklären befleckt worden Das Leiter-wie Array von Division Septen, die in der Regel früh während der Sporenbildung gesehen werden.
Die anfängliche Phänotypisierung Strategien hier beschriebenen sollte dazu führen, dass die folgenden: 1) Identifizierung mutierte Stämme von Interesse für weitere Untersuchungen; (2) erworbenen Kenntnisse über die neu identifizierten Mutante und die mögliche Rolle des Gens, das mutiert worden ist; (3) die Formulierung einer anschließenden Reihe von experimentellen Schritte, die zur weiteren Klärung der Rolle des betreffenden Gens verwendet werden können. Im Falle einer neu entdeckten Streptomycete aus der Umgebung gewinnen die Forscher wissen über möglichen neuen Arten, die im Vergleich zu Arten von Streptomycesbereits gekennzeichnet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> Abbildung 1: Foto von einer repräsentativen nährbodenplatte makroskopischen Kolonie Phänotypen von S. Coelicolordemonstrieren. Der Agarplatte zeigt die fuzzy, graue Optik des Mycels Antenne für Wildtyp S. Coelicolor Stamm MT1110 (WT) im Vergleich zu verschiedenen zufälligen Transposon Einfügung Mutanten mit Entwicklungsstörungen Phänotypen. Mutanten fehlen entweder eine Antenne Myzel [Kahl (Bld)] oder eine Antenne Myzel mit reduzierten Spore Pigmentierung [White (Whi)]. Transposon Mutanten wurden mit Mini-Tn5 für Einfügung Mutagenese6,7erzeugt. Die Stämme wurden auf MS-Agar für 5 Tage bei 30 ° c gewachsen. Petrischale Durchmesser 100 mm.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> Abbildung 2: Phasenkontrast-Aufnahmen zeigen einen Vertreter Antenne Filament für S. Coelicolor weißen Mutante Stämme mit zufälligen Transposon Einfügung Mutationen. (A) gezeigt ist eine repräsentative Wildtyp Antenne Filament, die synchron, regelmäßig verteilt Zellteilungen, produzieren gleichmäßig durchlaufen hat Form und Größe Sporen (MT1110). (B–F) Die restlichen Tafeln zeigen die sehr unterschiedlichen mikroskopische Phänotypen der verschiedenen weißen Mutanten, die per Zufallsprinzip Transposon Mutagenese isoliert wurden. Zentrale B zeigt eine Luftaufnahme Filament, die Sporenbildung nicht durchgemacht hat, aber stattdessen hat prall gefüllte Bereiche innerhalb der Heizfaden produziert. Lange Pfeile in C, Dund F zeigen ungewöhnlich große Sporen, die charakteristisch für Mutanten, MIC42, MIC43 und TH49. Der kurze Pfeil im Bedienfeld " D " gibt ein Beispiel für ein lysierten Spore-Fach. E zeigt die teilweise verengten kleinere Fächer, die typisch für die Spore-Ketten von Mutant TH10 produziert sind. Die Stämme wurden auf MS-Agar für 5 Tage bei 30 ° c gewachsen. Die Mutanten sind unabhängig von den in Abbildung 1dargestellten. Eine Wildtyp-Spore ist etwa 1,1 µm auf der Längsachse. Maßstabsleiste = 2 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative mikrographen zeigt S. Coelicolor mutierte Chromosom Abtrennung Phänotypen. (A) A Diagramm Darstellung zeigt das typische Wildtyp, regelmäßig verteilt Färbung aussehen für eine Kette von Sporen (jede Spore enthält chromosomalen DNA) zum intermittierenden Färbung Muster für eine Mutante verglichen, die ein Chromosom zeigt Segregation ist defekt. (B) zeigt jedes Paar Platten der gleichen Spore Kette von Differential Interferenz Kontrast (DIC) Bild auf der linken Seite beobachtet und eine Propidium Jodid-gefärbten fluoreszenzbild wird auf der rechten Seite angezeigt. Der Wildtyp Phänotyp (a, b) ist im Vergleich zu zwei zufällige Transposon Einfügung Mutanten (c, d und e, f). Die Pfeile geben die Sporen frei von DNA. Die Stämme wurden auf MS-Agar für 5 Tage bei 30 ° c gewachsen. Die Mutanten gezeigt sind unabhängig von den in Abbildung 1 und Abbildung 2. Maßstabsleiste = 1 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> Abbildung 4: Fluoreszenz Schliffbild S. Venezuelae Wildtyp Stamm mit WGA-FITC befleckt. (A) A Diagramm von einer Antenne Filament erscheint glatt mit keine Einbuchtungen und hat keine sichtbaren Anzeichen der Sporenbildung mit Phasenkontrast-Mikroskopie im Vergleich zu den Leiter-wie Array der Zellwand Färbung, die angibt, einem frühen Stadium der Sporenbildung in diesem gleichen Filament mit WGA-FITC unter Fluoreszenz-Mikroskopie begonnen. (B) Aufnahmen von Wildtyp S. Venezuelae. (ein) reibungslose Luftaufnahmen Filamente sind bei den Ketten der Sporen. (b) in das Myzel im Panel angezeigt, eine Antenne Glühfaden in einem frühen Stadium in der Entwicklung besitzt eine Strichleiter-wie Array der Zellwand Ablagerung. Pfeile zeigen die regelmäßig verteilt Bildung von Kreuz-Wände gebeizt von WGA-FITC, die synchron innerhalb einer einzigen Antenne Filament zu entwickeln, wie es Entwicklungsgeschichtlich verbundenen Sporenbildung erfährt. Der Stamm wuchs auf MYM (MAltose, Y-Osten-Extrakt, MAlt Extrakt) MYM Agar 38 h bei 30 ° C. Maßstabsleiste = 2 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuelle und Mikroskopische Auswertung von Streptomyces Entwicklungsstörungen Mutanten

Hier stellen wir Protokolle für Anfänger Forscher um Phänotypisierung für die pharmakologisch wichtigen bakteriellen Gattung Streptomyceszu initiieren.

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

17.7K Aufrufe.  Otterbein University. Hier stellen wir Protokolle für Anfänger Forscher um Phänotypisierung für die pharmakologisch wichtigen bakteriellen Gattung Streptomyceszu initiieren.

Serie: Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Forschung

Genetik

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Biochemie

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biologie

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Studium der oxidativen Stress verursachten Mitis Gruppe Streptokokken in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Entwicklungsbiologie

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Fluoreszenz Zeitraffer-Bildgebung des kompletten<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Life Cycle Mikrofluidikvorrichtung Verwendung

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Immunologie und Infektion

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Visuelle und Mikroskopische Auswertung von Streptomyces Entwicklungsstörungen Mutanten

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Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

Studium der oxidativen Stress verursachten Mitis Gruppe Streptokokken in Caenorhabditis elegans

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Fluoreszenz Zeitraffer-Bildgebung des kompletten

Genomweiten Gen-Deletionen in

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt