In diesem Protokoll zeigen wir, wie man eine freie Lebensmethode c. elegans verwendet, um die Pathogenität zu klären, die durch Wasserstoffperoxid verursacht wird, das über Mitis Group streptococci erzeugt wird. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir Pathogenität und die Aktivierung von Stressreaktionen im Wurm studieren können, indem wir eine nachhaltige biologische Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies im Gegensatz zu chemischen Quellen verwenden Für einen Liter Medien 30g Todd Hewitt Pulver, 2g Hefeextrakt und 20g Ager zu einem 2-Liter-Erlin Myer Kolben hinzufügen.
970ml entionisiertes Wasser in den Inhalt des Kolbens geben und in eine Rührstange geben. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um die Öffnung zu bedecken. Autoclave die Medien in der Flasche bei einer Temperatur von 121 Grad Celsius und Druck von 15 Pfund pro Quadratzoll für 30 Minuten.
Danach den Kolben auf eine Rührplatte stellen, um ihn mit sanftem Rühren abzukühlen. Unter einer laminaren Haube, gießen Sie die Medien in entsprechend große, sterile Petri-Gerichte. Lassen Sie die Medien 2 Stunden trocknen.
Danach lagern sie die Platten bei 4 Grad Celsius für bis zu 1 Monat. Vor der Zubereitung von Mitis Group Streptokokken, erwärmen Sie die THY AgarPlatten in einem Brutkasten auf 37 Grad Celsius. Danach verwenden Sie eine sterile Schleife, um gewünschte Stämme von Strepticocci auf den Stellen auszustreichen.
Dann legen Sie die Teller in ein Kerzenglas und bebrüten das Glas bei 37 Grad Celsius über Nacht für etwa 18 Stunden, um eine mikroerophile Umgebung zu schaffen. Am nächsten Tag, entfernen Sie die Platten aus dem Kerzenglas und verwenden Sie eine sterile Schleife, um isolierte Kolonien zu pflücken. 15 ml sterile konische Röhrchen mit 2 ml THY-Brühe impfen.
Schließen Sie die Kappen fest und bebrüten Sie die Rohre bei 37 Grad Celsius unter statischen Bedingungen. Vorwärmte THY-Platten in einem Inkubator auf 37 Grad Celsius fügen 50 Mikroliter Lösung mit 1000 Einheiten Kataalase auf die THY-Platte. Verwenden Sie einen sterilen Streuer, um die Katalawase-Lösung zu verteilen und lassen Sie die Platten auf der laminaren Strömungshaube für 30 Minuten trocknen.
Um die Platten mit den Streptokokkenstämmen auszusäen, verwenden Sie eine Pipette, um 80 Mikroliter über Nacht angebaute Kulturen auf die Platte zu bringen und verwenden Sie einen sterilen Streuer, um die Bakterien vollständig über die Agaroberfläche zu verteilen. Die Teller bei 37 Grad Celsius in einem Kerzenglas über Nacht bebrüten. Als Kontrolle, auf zwei NGM-Platten, fügen Sie 80 Mikroliter der über Nacht gewachsenen Kulturen von E.coli OP-50 für die Aussaat.
Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Am nächsten Tag die Teller aus dem Kerzenglas entfernen und die Platten auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Mit einem sterilen Wurmpick 30 L4-Larven von den NGM-Futterplatten auf die streptokokkensamen THY-Platten übertragen.
Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius. Zählen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die Anzahl der lebenden und toten L4-Larven auf jeder Platte zu mehreren Zeitpunkten. Verwenden Sie die sterile Wurmpick, um die Würmer vorsichtig zu prod und festzustellen, ob sie tot oder lebendig sind.
Zuerst, punkten Sie die Würmer als tot oder leben alle 30 Minuten. Wenn Würmer schnell zu sterben beginnen, punkten Sie sie im 15-Minuten-Takt. Der Test dauert 5 bis 6 Stunden.
Danach wiederholen Sie das Experiment noch zwei Weitere Male. Um das Agarose-Pad vorzubereiten, kleben Sie Labtape längs entlang zweiglaser Dias. Dadurch wird die Dicke der Agarose-Pads bestimmt.
Platzieren Sie eine saubere Glasrutsche zwischen den beiden verklebten Dias. Lösen Sie Agrose in entionisiertem Wasser, um 2 Gewichtsvolumenprozent zu machen und erhitzen Sie die Lösung in einer Mikrowelle. Verwenden Sie eine Pipette, um 100 Mikroliter geschmolzene Agarose in der Mitte des sauberen Schlittens zu platzieren.
Legen Sie sofort eine weitere saubere Glasrutsche auf die geschmolzene Agarose und drücken Sie vorsichtig nach unten, um ein Pad zu machen. Lassen Sie die Agarose verfestigen und entfernen Sie anschließend die obere Folie. Das Agarose-Pad ist einsatzbereit.
Vorwarme THY-Platten auf 37 Grad Celsius. Säen Sie die Platten mit einem Streptokokken-Stämme, wie zuvor in den Überlebenstests getan. Samen 3 NGM Platten mit E-coli OP-50 als Kontrolle und inkubieren bei 37 Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Tag die Platten auf Raumtemperatur abkühlen. Verwenden Sie den M9W-Puffer, um L4-Larven aus NGM- oder NGM RNAi-Zuführungsplatten in 15 ml konische Röhrchen zu waschen. Drehen Sie die Rohre bei 450 mal g, für eine Minute in einer Zentrifuge.
Dekantieren Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml M9W in jede Tube. Wiederholen Sie den Zentrifugalschritt noch dreimal. Die Würmer in 250 Mikroliter M9W wieder aufhängen und drei 5 Mikroliter Tropfen der Schneckensuspension auf einen sauberen Petrischalendeckel legen.
Schätzen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die Anzahl der Würmer pro Mikroliter. Mit einer Pipette ca. 100 L4-Larven zu jedem THY Streptokokken-Samen und NGM E.coli-Samenplatten hinzufügen. Verwenden Sie drei Platten pro Bakterienstamm.
Inkubieren Sie die Platten für 2 bis 3 Stunden bei 25 Grad Celsius. Danach entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator. Waschen Sie sie mit M9W und sammeln Sie die Würmer in 15ml konischen Schläuchen.
Waschen Sie die Würmer dreimal wie zuvor im Zentrifugalschritt. Entfernen Sie den größten Teil des M9W durch Aspiration. Und fügen Sie 500 Mikroliter M9W mit 2 Millimolaren Natriumazid oder Tetramisolehydrochlorid in das Wurmpellet zur Anästhesie.
Inkubieren Sie das Rohr mit Wurmpellets bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Dann 15 Mikroliter der Schneckensuspension auf ein vorbereitetes Agorosepad fallen lassen. Visualisieren Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop die Lokalisierung von skn-1 unter Verwendung von Fitzy- und Dappy-Filtern.
Bildwürmer bei 10-facher und 20-facher Vergrößerung. Bewerten Sie die Würmer auf der Grundlage von drei Lokalisationsebenen;niedrige Lokalisierung, bei der keine nukleare Lokalisierung beobachtet wird, mittlere Lokalisierung, mit SKN 1 BCGFP im Vorderen oder Hinterteil des Wurms und hoher Lokalisierung, wo die nukleare Lokalisierung von skn-1 BCGFP in allen Darmzellen beobachtet wird. In diesem Experiment töteten Mitglieder der Mitis-Gruppe die Würmer schnell, im Gegensatz zu S.mutans, S.salivarius und nicht pathogenen E.coli OP-50.
Als die Kataalase zu THY ager ergänzt wurde, wurde das Töten der Würmer abgeschafft. Der Tod der Würmer wurde auf der Delta spxB mutierten Sorte im Vergleich zu den Wildtyp- und Komplimentstämmen nicht beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass das von der Mitis-Gruppe produzierte Wasserstoffperoxid die Tötung der Würmer vermittelt.
Im Vergleich zu den mit Vektorsteuerung behandelten Würmern wurde eine signifikante Abnahme des Überlebens der skn-1 Knockdown-Würmer beobachtet. Ein ähnlicher tötender Phänotyp wurde mit dem skn-1 Mutantenstamm und den N2-Wildwürmern beobachtet. Dies zeigt, dass skn-1 das Überleben der Würmer auf der Mitis-Gruppe beeinflusst.
Die Lokalisierung von skn-1 BCGFP wurde bei Würmern beobachtet, die den Wildtyp-N-Kompliment-Stämmen ausgesetzt waren und nicht als Reaktion auf den Delta spxB mutierten Stamm der S cordonae. Nachdem Komponenten des P38-Kartenkinasewegs abgerissen wurden, wurde eine reduzierte Lokalisation von skn-1 BCGFP und knockdown behandelten Würmern im Verhältnis zu den vektorkontrollbehandelten Würmern beobachtet. Durch die Verwendung der Streptokokken c.
Elegans System, die Auswirkungen von Wasserstoffperoxid auf endoplasmatische verticulare Belastung, mitochondriale Schäden, Mitophogy, und Tophogie können weiter untersucht werden. Darüber hinaus können Mechanismen identifiziert werden, durch die Wasserstoffperoxid als Virilszenzfaktor wirkt, um Immunreaktionen auszulösen, indem Kernprozesse der Zelle gestört werden.
