Es gibt keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.

Alle Tierpflege und experimentelle Verfahren befolgt die Leitlinie vom National Institutes of Health und institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) an der University of Michigan. Verwenden Sie RNase-freie Lösungen und Tipps im gesamten Protokoll pipette. Reinigen Sie der Arbeitsbereich, Pipetten, Schläuche und Zentrifuge mit RNase Dekontaminationslösung nach den Herstellerrichtlinien (siehe Materialtabelle).
1. SgRNA Zielauswahl
<ol><li>Mit einem Webbrowser, öffnen Sie die Webseite: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>Eingabe von ~ 60 Basenpaaren (bp) Sequenz flankieren die gewünschte Bearbeitung von Interesse (d.h. 30 bp 5' und 3' des gewünschten bearbeiten).</li>
		<li>Wählen Sie das Caenorhabditis Elegans Genom aus dem Pulldown-Menü.</li>
		<li>Wählen Sie die Protospacer angrenzenden Motiv (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) aus dem Pulldown-Menü.</li>
		<li>Klicken Sie auf Absenden. Wählen Sie auf der Ergebnisseite der oberste Rang Zielsequenz am nächsten an die Bearbeitung von Interesse. Wenn kein geeignetes Ziel Standorte innerhalb der flankierenden 60 bp Eingabesequenz vorhanden sind, erweitern Sie die Reihenfolge der Abfrage bis zu 100 bp (d.h. 50 bp beiderseits des gewünschten bearbeiten).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aus einer verfügbaren Quellen, z. B. Synthego, erhalten eine 20-Mer Ziel SgRNA mit den folgenden Spezifikationen: 3 Nmol; keine Änderungen.</li>
	<li>Nach Erhalt, Zentrifugieren lyophilisierten SgRNA mit Schlauch an > 12.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Das Rohr 60 µL Nuklease-freie TE hinzu, und auszusetzen Sie sanft wieder nach oben und unten 15 - 20 Mal mit einer P200 Pipette pipettieren. Die Endkonzentration beträgt 50 µM.</li>
</ol>(2) Homologie gerichtete Reparatur-Template-Design
<ol><li>Entwerfen einer SsODN HDR Vorlage enthält: (1) die Mutation von Interesse, (2) ein einzigartiges in-Frame Beschränkung Endonuklease Website, (3) eine Stille Mutation von einem oder beiden der Gs innerhalb der NGG PAM-Sequenz, und (4) 50 bp 5' und 3' Homologie Arme flankieren die erste und letzte Mutation. (Abbildung 1) 9 , 10.<ol>
<li>Wenn Mutation der NGG PAM-Sequenz nicht möglich ist, stellen Sie ca. 5-6 Stille Mutationen innerhalb der SgRNA Anerkennung Zielsequenz, SgRNA-vermittelte Spaltung der SsODN HDR Vorlage zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aus einer verfügbaren Quellen, z. B. Idtdna, erhalten eine "Ultramer DNA-Oligonukleotid" mit den folgenden Parametern: Skala: 4 Nmol; Formulierung: Keine; Reinigung: Standard Entsalzung.</li>
	<li>Nach Erhalt, Zentrifugieren lyophilisierten SsODN mit Schlauch an > 12.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Auszusetzen Sie vorsichtig wieder SsODN, eine Endkonzentration von 100 µM Nuklease-freie DdH2O durch nach oben und unten 15 - 20 Mal mit einer P200 Pipette pipettieren.</li>
</ol>3. Design Genotypisierung Primer
<ol><li>Entwerfen Sie eine Grundierung, die voraussichtlich eine ~ 400-700 bp PCR Amplifikate11generieren flankieren die Genom-Modifikation.</li>
	<li>Optimieren Sie PCR Radfahren Bedingungen, ein Einzel- und spezifischen Amplifikate11zu produzieren.</li>
</ol>4. Injektion Mischung vorbereiten
<ol><li>Zentrifugieren Sie Tabelle 1 Reagenzien mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Fügen Sie in der aufgeführten Reihenfolge Tabelle 1 Reagenzien zu einem Nuklease-freie PCR-Schlauch hinzu.</li>
	<li>Mischen von pipettieren sanft nach oben und unten 10 mal mit einer Pipette P20.</li>
	<li>Inkubieren Sie Injektion-Mix für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
</ol>5. Injektion Protokoll
<ol><li>Last Injektion Mikropipette mit ungefähr Hälfte der Injektion mischen12. Speichern Sie verbleibende Injektion Mischung für den Fall, dass die Injektionsnadel verstopft oder bricht.</li>
	<li>Mikropipette Spitze zu brechen, so dass ~ 20-30 p.s.i. eine allmähliche fließende Lösung12produziert. Hinweis: Größere Durchmesser Tipps negativ beeinflussen Tiergesundheit und F1 Nachkommen Ausbeute zu verringern.</li>
	<li>Injizieren von 10-15 junge Erwachsene Würmer in beiden Gonaden Armen möglichst12. Ist dies nicht der Fall, Injektion in einen Gonaden Arm reicht.</li>
	<li>Lassen Sie injizierte Tiere (P0) für 1-2 h bei Raumtemperatur wieder auf eine 35 mm OP50 ausgesät Nematoden Medien (NGM) Wachstumsfuge zu. Anschließend wählen Sie injizierten P0 Einzeltiere zu einzelnen OP50 entkernt 35 mm NGM Platten mit einem Platindraht Wurm12.</li>
</ol>6. P0 Siebbleche und einzelne mCherry(+) F1s
<ol><li>Zwei Tage nach der Injektion, P0 Platten mit F1 Nachkommen mit dem Ausdruck mCherry in den Rachenraum mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop zu identifizieren (Abbildung 1, Tag 2: 3). Wählen Sie drei P-0 -Platten, die die meisten mCherry(+) F1 Tiere enthalten.</li>
	<li>Aus jedem der drei ausgewählten P0 Platten, einzelne 8-12 mCherry(+) F1 Tiere für eine Gesamtmenge von 24-36 mCherry(+) F1s mit einem Wurm wählen (Abbildung 1, Tag 2: 3). Hinweis: mCherry(-) Tiere können auch von diesen P-0 -Platten ausgezeichnet, aber die Wahrscheinlichkeit korrekt identifizieren bearbeitet Tiere ist viel niedriger (Abb. 2A).</li>
	<li>Ermöglichen Sie individuelle F1s self-fertilize und Eier für 1-2 Tage bei Raumtemperatur.</li>
</ol>7. Single Worm PCR und Genotypisierung
<ol><li>Übertragen Sie nach 1-2 Tagen eierlegende die F1s in einzelnen PCR-Streifen Rohr Kappen mit 7 µL Wurm Lysis Puffer mit einem Wurm-Pick ( Abbildung 1,Tabelle 2, Tag 4-5).</li>
	<li>Zentrifuge PCR-Röhrchen mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur zu bringen Tiere den Rohrboden und Einfrieren von Rohren bei-80 ° C für 1 h. Hinweis: Würmer können bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.</li>
	<li>Lösen Sie gefrorene Würmer in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm: 60 ° C für 60 min, 95 ° C für 15 min, 4 ° C halten.</li>
	<li>Set-up PCR Mastermix wie in Tabelle 3dargestellt.</li>
	<li>Fügen Sie 21 µL des PCR Mastermix in saubere PCR-Röhrchen, und fügen Sie 4 µL Wurm Lyse aus Schritt 3. Mischen Sie gut mit einer Pipette und führen Sie PCR-Programm nach den Hersteller-Richtlinien (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>PCR-Reaktionen mit einem DNA-sauber und Konzentrat-Kit, Anschluss an die Anweisungen des Herstellers zu reinigen (siehe Materialtabelle). Eluieren Sie DNA durch Zugabe von 10 µL Wasser auf die Spin-Spalte.</li>
	<li>Set-up Restriktionsenzym Mastermix wie in Tabelle 4dargestellt.</li>
	<li>Jeder gereinigten PCR Reaktion 10 µL Restriktionsenzym Mastermix hinzu und inkubieren Sie für 1-2 h bei 37 ° C13.</li>
	<li>Separate verdaut PCR-Produkte auf einem 1,5 % Agarose-Gel bei 120 V mit 1 X Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer14laufen.</li>
</ol>8. Feststellung und Überprüfung der Reihenfolge der bearbeiteten Tiere
<ol><li>Untersuchen Sie Enzym verdaut Proben für die Anwesenheit von Bands, die darauf hinweisen, dass Potenzial Tiere14 (Abbildung 1, Tag 4-5) bearbeitet. Hinweis: Laden Sie eine N2-Steuerelement, um potenzielle Indel Mutationen zu identifizieren, die als Veränderungen in der Bandgröße und/oder unerwarteten und komplexen Beschränkung Enzym Verdauung Streifenbildung Muster beobachtet werden kann.</li>
	<li>Verwenden Sie nach der Identifizierung potenzieller bearbeiteten Tiere die verbleibenden 3 µL Wurm Lyse und wiederholen der PCR-Reaktion. Nicht reinigen oder Restriktionsenzym verdauen der PCR-Reaktion, nachdem das Programm beendet ist. Die PCR-Reaktion auf einem 1 % Agarosegel, separate laden und extrahieren Sie die Band mit einem Gel Extraction Kit15 (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Sanger Sequenz16 Gel extrahiert DNA mit Hilfe des F1-Primers zur Identifizierung richtig bearbeiteten Tiere (Abbildung 1A) Hinweis: Heterozygot liest enthalten werden überlagert Gipfeln aufgrund des Vorhandenseins von dem Wildtyp und Allel entwickelt.</li>
	<li>Homozygote Tiere von verifizierten heterozygot bearbeiteten Tiere, einzelne 8-122 Tiere und führen Sie die Schritte 7-8.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms.">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li><li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. 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K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient,+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. 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DNA Gel Electrophoresis .</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Gel+Purification.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Estrada-Rivadeneyra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sanger+sequencing.">Sanger sequencing.</a> FEBS J. , (2017).</li><li>Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).</li><li>Evans, T. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balanced+Look+at+the+Implications+of+Genomic+(and+Other+&amp;#34;Omics&amp;#34;)+Testing+for+Disease+Diagnosis+and+Clinical+Care.">A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other &amp;#34;Omics&amp;#34;) Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care.</a> Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).</li><li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li></ol>

Wir danken Mitglieder des Beg-Labors für kritische Lektüre des Manuskripts. Stämme lieferte Caenorhabditis Genetik Zentrum, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Forschung im Labor Beg wird durch Zuschüsse aus dem NIH (R01 NS094678) und die Muscular Dystrophy Association (MDA382300), A.A.B. unterstützt.

Das CRISPR-Cas9-System ist ein leistungsfähiges und effektives Werkzeug für präzise Änderung des Genoms von Modellorganismen. Hier zeigen wir die Chimäre SgRNAs20 in Verbindung mit SsODN HDR Vorlagen ermöglichen hoch effiziente Erzeugung von genomischen Punktmutationen in C. Elegans. Wichtig ist, zeigen wir, dass RNP Lieferung hocheffiziente Bearbeitung erzeugt, wenn Fluoreszenz dient als ein Co Selektionsmarker, Hervorhebung der Benutzerfreundlichkeit und Zuverlässigkeit der Techn...

Jüngsten technologischen Fortschritte haben radikal umgewandelt und beschleunigt die Fähigkeit, genau Ingenieur Genome. Insbesondere wurde das CRISPR-Cas9-System, das stützt sich auf die RNA-geführte Endonuklease Cas9 induzieren eine Doppelstrang-Pause (DSB) in der Nähe der Zielsequenz von Interesse, weitgehend verwendet, um genau das Genom der Mehrheit der verwendeten Modellorganismen Ingenieur Biomedizinische Forschung1,2,3,4. Bezeichnenderweise hat die Verwendung von CRISPR-Cas9 freigeschaltet Genom-Bearbeitung auch bei schwierigen Arten wie C. Elegans5. Unabhängig von der Spezies, Generierung von Punktmutationen mit dem Redaktionssystem CRISPR-Cas9 Basis-Genom stützt sich auf drei Kernkomponenten: (1) Cas9 Endonuklease, 2) einen einzigen Führer RNA (SgRNA), die Cas9 Endonuklease einer Zielsequenz und (3) ein Benutzer entwickelt, leitet unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) Vorlage mit dem gewünschten edit(s) von Interesse2.
Es gibt mehrere Methoden, die verwendet werden können, die gezielt SgRNA und Cas9 einzuführen Nuklease in Zellen einschließlich Plasmid, RNA und viral-basierte Lieferung Methoden6. Vor kurzem hat Direktlieferung von Pre-komplexiert SgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) als ein leistungsfähiges und effizientes Werkzeug im CRISPR-Cas9-basierte Genom Bearbeitung7entstanden. Die direkte Zustellung von Pre-komplexiert CRISPR-Cas9-RNPs hat einige deutliche Vorteile, nämlich: (1) RNPs umgehen die Notwendigkeit einer zellulären Transkription und Übersetzung, 2) RNPs sind schnell gelöscht, Spezifität erhöhen durch Verringerung der zur Verfügung stehende Zeit für Ziel Spaltung und 3) RNPs enthalten keine fremden DNA/RNA-Elemente, die die Einführung von Gebietsfremden Sequenzen in das wirtsgenom durch zufällige Integration umgeht. Zusammen bieten diese Attribute wahrscheinlich eine kurzlebige Platzen der zielgerichtet CRISPR Bearbeitung bei gleichzeitiger Minimierung der Ziel-Effekte.
Ein einfaches und effizientes Protokoll für die Einführung von standortspezifischer genomischer Veränderungen in C. Elegansbeschrieben. Dieses Protokoll enthält targeting SgRNA und einzelne gestrandeten Oligonukleotid (SsODN)-HDR-Template-Design, SgRNA-Cas9 RNP Komplexbildner und Lieferung und eine Genotypisierung Strategie für die eindeutige Kennzeichnung der richtig bearbeiteten Tiere. Mit dieser Strategie, nicht nur die gewünschten Site-spezifische Änderungen zurückgewonnen werden, aber andere unspezifische Indel Mutationen können auch wiederhergestellt werden. So, unsere Strategie erlaubt die Generation der ein Allel Serie mit einer einheitlichen Strategie, wo Mono-Allele, Bi-Allel und Indel Mutanten in der F-1 Generation erzeugt werden können.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&amp;nbsp; EZ Kit</td><td>Synthego Inc.</td><td></td><td>chimeric sgRNA</td></tr><tr><td>Nuclease-free TE</td><td>Synthego Inc.</td><td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Synthego Inc.</td><td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td><td></td></tr><tr><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>ssODN HDR template</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1078728</td><td>Cas9 protein</td></tr><tr><td>pCFJ90&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean &amp;amp; Concentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Glass Borosilicate Glass Micropipettes</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-78-10</td><td>OD: 1.0mm. ID: 0.78mm</td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Decontamination Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and facile pipeline for generating genomic point mutants in c. elegans using crispr/cas9 ribonucleoproteins

Die gruppierten regelmäßig eingestreuten palindromischen Wiederholungen (CRISPR) - CRISPR - assoziierten Protein 9 (Cas9) prokaryotische adaptive Immunabwehr als ein mächtiges Werkzeug für präzise eukaryotische Genom Engineering kooptiert worden hat. Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle und einfache Methode mit Chimären einzelne Guide RNAs (SgRNA) und CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) für die effiziente und präzise Generation von genomischen Punktmutationen in C. Elegans. Wir beschreiben eine Pipeline für SgRNA Zielauswahl, unter der Regie von Homologie (HDR) Vorlage Reparaturverfahren CRISPR-Cas9-RNP Komplexbildner und Lieferung und eine Genotypisierung-Strategie, die die robuste und schnelle Identifizierung von richtig bearbeiteten Tiere ermöglicht. Unser Ansatz ermöglicht die einfache Erzeugung und Identifizierung des gewünschten genomische Punkt mutierte Tiere nicht nur, sondern erleichtert auch den Nachweis von anderen komplexen Indel Allele in ca. 4-5 Tage mit hohem Wirkungsgrad und einer reduzierten Screening Arbeitsauslastung.

Mutationen im menschlichen Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) entfallen ca. 10-20 % der familiäre Amyotrophe Lateralsklerose, eine verheerende Neurodegenerative Erkrankung, die unweigerlich zu Lähmung und Tod17führt. Menschlichen SOD-1 ist ein evolutionär konservierte Protein 55 % Identität und 70 % Ähnlichkeit mit C. Elegans SOD-1-Proteins (Abbildung 1 b) zu teilen. Um die Einfachheit, Machbarkeit und Effizienz der C...

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A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Hier präsentieren wir eine Methode, um das Genom von C. Elegans Ingenieur CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins und Homologie abhängigen Reparatur Vorlagen.

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

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Serie: A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Genetik

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been harnessed by researchers to study important biologically relevant problems. The unparalleled power of the CRISPR/Cas genome editing method allows researchers to precisely edit any locus of their choosing, thereby facilitating an increased understanding of gene function. Several methods for editing the C. elegans genome by CRISPR/Cas9 have been described previously. Here, we discuss and demonstrate a method which utilizes in vitro assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. Specifically, in this article, we go through the step-by-step process of introducing premature stop codons into the C. elegans rbm-3.2 gene by homology-directed repair using this method of CRISPR/Cas9 editing. This relatively simple editing method can be used to study the function of any gene of interest and allows for the generation of homozygous-edited C. elegans by CRISPR/Cas9 editing&#160;in less than two weeks.

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The goal of this protocol is to enable seamless CRISPR/Cas9 editing of the C. elegans genome using assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. This protocol can be used to make a variety of genetic modifications in C. elegans including insertions, deletions, gene replacements and codon substitutions.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Konstruktion homozygoter Mutanten der Wanderheuschrecke mittels CRISPR/Cas9-Technologie

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

Biologie

Single Worm PCR: A Method to Extract and Amplify Genomic DNA

Source: Prior, H., et al. <a href="https://www.jove.com/video/57518/a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c">A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in&#160;C. elegans&#160;Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes a technique to rapidly screen a single nematode for a genetic marker by PCR screening. In the example protocol, we screen for CRISPR-based genome editing.