Ein wirtschaftliches und vielseitiges Hochdurchsatz-Proteinreinigungssystem mit einem Mehrsäulenplattenadapter. Hallo, Proteinreinigung ist für die Untersuchung der Proteinstruktur und -funktion unerlässlich. Und es wird normalerweise in Kombination mit biophysikalischen Techniken verwendet.
Dies ist besonders wichtig im Zeitalter der funktionellen Proteomik, die eine Proteinproduktion mit hohem Durchsatz erfordern. Wir stellten die Hypothese auf, dass ein Mehrsäulenplattenadapter, der MCPA, mehrere Chromatographiesäulen verschiedener Harze mit Multi-Well-Platten zur parallelen Reinigung verbinden kann. Mit diesem Adapter haben wir eine wirtschaftliche und vielseitige Methode der Proteinreinigung entwickelt, die unter Schwerkraft oder Vakuumkonkurrent in der Geschwindigkeit eines automatisierten Systems eingesetzt werden kann.
Hier zeigen wir diese Methode für die Nickelaffinitätschromatographie und Ionenaustauschchromatographie. Montieren Sie den MCPA, indem Sie eine punktierte Dichtmatte auf eine lange Tropfplatte legen und dann die gewünschte Anzahl von Säulen in die Löcher der Dichtmatte einführen. Legen Sie eine offene Auffangplatte in die Basis des Verteilers und schließen Sie mit der Oberseite des Verteilers.
Befestigen Sie Schläuche und legen Sie den montierten MCPA mit Säulen auf die Oberseite. Pipetieren Sie 1,2 mil der Nickel-NTA-Lösung in die Säulen. Achten Sie beim Pipettieren darauf, dass die Perlen vollständig vermischt bleiben.
Schalten Sie die Pumpe ein und führen Sie das 20% Ethanol durch die Säulen und in die darunter stehende Auffangplatte. Schalten Sie die Pumpe aus, sobald die Flüssigkeit durchläuft ist. Entsorgen Sie den Inhalt der Sammelplatte in einer Abfallbox.
Fügen Sie drei Harzvolumina EDTA-Puffer zu allen Säulen hinzu. Schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie die Flüssigkeit durch. Waschen Sie nun die Säulen mit drei Harzvolumina aus 0,5 molaren Natriumhydroxidpuffern.
Waschen Sie die Säulen mit vier Harzvolumina von 100 Millimolar-Nickelsulfat, dann 10 Harzvolumina Mili-Q-Wasser. Wenn eine Säule langsamer läuft, drücken Sie die Flüssigkeit mit dem Spritzenkolben durch. Gießen Sie den Inhalt der Sammelplatten in eine Abfallbox.
Anschließend die Säulen zweimal mit vier Harzvolumina aus 10 Millimolar imidazol Waschpuffer waschen und die Auffangplatten entleeren. Wenn mehrere Proben gereinigt werden, ersetzen Sie die offenen Auffangplatten durch eine 48-Well-Platte. Laden Sie bei ausgeschaltetm Vakuum die Lysate in die Säulen.
Verwenden Sie einen dünnen Kunststoffrührer, um die Perlen und die Lysate in der Säule vorsichtig zu mischen, um die Bindung zu maximieren. Schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie die Flüssigkeit durch. Wenn eine Säule blockiert wird, wird die Lysatharzmischung mit einem frischen Filter auf eine Säule übertragen.
Frieren Sie die Auffangplatten ein, um Ihren Durchfluss einzudämmen. Ersetzt durch eine offene Auffangplatte und dann waschen Sie die Säulen mit neun Harzvolumina von 10 Millimolar-Imidazol-Waschpuffer. Wiederholen Sie diesen Schritt vier- oder fünfmal.
Um ein Überlaufen zu vermeiden, leeren Sie regelmäßig die Abfallplatten. Ersetzen Sie die offenen Auffangplatten durch eine 96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass sich A1 in der oberen linken Ecke befindet. Pipettieren Sie ein Harzvolumen des denaturierenden Elutionspuffers in die Säulen.
Führen Sie die Flüssigkeit durch und überprüfen Sie die Auffangplatte, um sicherzustellen, dass keine Verunreinigung zwischen den Vertiefungen vorliegt. Für die nächste Verdünnung wiederholen Sie die vorherigen Schritte und sammeln Sie sie in einer frischen Auffangplatte. Nehmen Sie ein Aliquot von 50 Mikrolitern von jeder Elution für die Reinheits- und Konzentrationsanalyse.
Als nächstes waschen Sie die Säulen mit zwei Millilitern 20% Ethanol. Fügen Sie weitere zwei mil 20% Ethanol zu den Säulen hinzu und verwenden Sie den frischen dünnen Kunststoffrührer, um die Perlen im Ethanol zu mischen, bevor Sie in ein 50 mil Rohr zur Lagerung bei vier Grad Celsius übergehen. Montieren Sie den MCPA im Vakuumverteiler mit einer offenen Auffangplatte und Spritzenkolben in allen Säulen.
Entfernen Sie alle Spritzenkolben aus der ersten Reihe. Entfernen Sie die Gummidichtung aus einem fünf Mil Spritzenkolben und durchbohren Sie dann ein Loch in der Mitte. Drücken Sie dann den Boden einer offenen Säule durch die punktierte Gummidichtung.
Wiederholen Sie diese Schritte, und fügen Sie sie in die erste Zeile der Spalten ein. Stellen Sie sicher, dass die Q Sepharose-Perlen vollständig gemischt sind. Und mit der blauen Pipettenspitze, die zwei Zentimeter von unten geschnitten ist, pipetieren Sie 800 Mikroliter der Q Sepharose-Perlen in die offenen Säulen.
Sobald sich die Perlen am Boden der Säulen abgesetzt haben, schalten Sie die Vakuumpumpe so ein, dass das 20% Ethanol durchläuft. Waschen Sie die Säulen zweimal mit zwei mil 10 Millimolar Tris. Schalten Sie die Pumpe aus, kurz bevor der Tris-Puffer durchgelaufen ist, um ein Austrocknen des Harzes zu verhindern.
Abfluss kann verworfen und durch eine 48-Well-Sammelplatte ersetzt werden. Alle zu reinigenden Proben werden in die Q Sepharose-Säulen in der ersten Reihe überführen und mit einem dünnen Kunststoffrührer die Proben und die Perlen etwa zwei Minuten lang gemischt, bevor sie die Vakuumpumpe einschalten. Speichern oder frieren Sie Ihren Flow-Through für eine spätere Analyse ein.
Waschen Sie die Säulen mit einer offenen Auffangplatte zweimal mit zwei mil 10 Millimolar Tris. Ersetzen Sie die offenen Auffangplatten durch die 96-Well-Platte. Die erste Elutionsfraktion kann in der ersten Reihe oder in der zweiten Reihe gesammelt werden.
Um in der zweiten Reihe zu eluieren, entfernen Sie die Spritzenkolben aus diesen Positionen. Bewegen Sie die Q Sepharose-Säulen in diese Positionen und platzieren Sie dann Spritzenkolben in den offenen Spalten in der ersten Zeile. Einen Milliliter der ersten Salzkonzentrationen in die Q Sepharose-Säulen pipeten.
Schalten Sie die Pumpe ein und sammeln Sie die Elution. Um die nächste Elution zu sammeln, entfernen Sie die Spritzenkolben von den nächsten Positionen, bewegen Sie die Q Sepharose-Säulen in diese Positionen und ersetzen Sie dann die Kolben in den vorherigen Positionen. Wiederholen Sie diese Schritte für jede nachfolgende Salzkonzentration, die zum Eluieren verwendet wird.
Stellen Sie sicher, dass für alle vier Elutionen eine neue Sammelplatte verwendet wird und dass jede Platte beschriftet und gelagert wird. Waschen Sie die Säulen mit einer offenen Auffangplatte mit zwei Mil von vier molaren Natriumchloriden, 10 Millimolar Tris. Pipeten Sie zwei mil 20% Ethanol und führen Sie dieses durch, bis es sich direkt über den Perlen befindet, und versiegeln Sie dann die Säulen für die Lagerung.
So hat das MCPA beispielsweise 14 AbpSH3-Mutanten unter Denaturierungsbedingungen erfolgreich durch eine Nickel-NTA gereinigt. Eine kleine Verunreinigung ist bei 25 Kilodalton zu sehen, obwohl das Protein immer noch weitgehend rein ist. Die kleinen Verunreinigungen, die bei der Denaturierung auftreten, werden unter nativen Bedingungen entfernt.
Dies zeigte sich, als 11 verschiedene SH3-Domänen gereinigt wurden. Dies zeigt, dass das MCPA zum Vergleich von Reinigungsbedingungen verwendet werden kann. AbpSH3 kann von den meisten Verunreinigungen durch Ionenaustauschreinigung aus Lysaten getrennt werden.
Gute Ausbeuten von beträchtlich reinem AbpSH3-Protein wurden mit verschiedenen höhermolekularen Verunreinigungen zurückgewonnen. Die Reinigung von Proben nach Nickel-NTA mittels Ionenaustausch mit dem MCPA hat diese hochgewichtigen Verunreinigungen erfolgreich entfernt. Obwohl es immer noch eine leichte Kontamination gibt, sind die Fraktionen immer noch weitgehend rein und haben mit NMR und thermischen chemischen Denaturierungstests gute biophysikalische Daten ergeben.
Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass unsere Hypothese richtig ist und dass das MCPA mit verschiedenen Chromatographietechniken erfolgreich Milligrammmengen an Proteinen reinigen kann. Das MCPA-System kann auf verschiedene Arten innerhalb derselben Läufe konfiguriert werden, um die Reinigungsbedingungen zu optimieren. Das Setup ist einfach, billig und leicht zu trainieren, unerfahrene Benutzer, insbesondere in Laboren, die Proteine nicht routinemäßig reinigen.
