Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der chronischen lymphatischen Leukämie zu beantworten, wie die genaue Prognose der Patienten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach, schnell und hochpräzise ist. Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zu robusten Prognostizierungen, insbesondere Risikozertifizierungen bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie, da die genaue Prognose später das therapeutische Management der Krankheit definieren kann.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, z. B. die PCR-Produktauswahl und die Analyse von Digest-Sequenzen sind schwer zu erlernen, da sie sowohl Präzision als auch Erfahrung erfordern. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie 200 Mikroliter EDTA zu einem 50 Milliliter sterilen Sammelrohr hinzu. Fügen Sie 20 Milliliter peripheres Blut und 15 Milliliter RPMI Medium in die Röhre und Pipette nach oben und unten zwei bis drei Mal zu mischen.
Als nächstes fügen Sie 15 Milliliter DichteGradient medium zu einem neuen 50 Milliliter Sammelrohr hinzu. Überlagern Sie die periphere Blutlösung langsam auf das Dichtegradientenmedium, um sicherzustellen, dass sie den Gradienten nicht stört. Zentrifuge bei 800 mal G für 20 Minuten mit der Zentrifuge bremse ab.
Verwenden Sie dann eine sterile Pasteur-Pipette, um den mononukleären Zellring zu sammeln, der sich zwischen der oberen Plasmaplättchenschicht und der Dichtegradienten-Mittelschicht gebildet hat, und übertragen Sie ihn in ein neues steriles 15-Milliliter-Sammelrohr. Fügen Sie RPMI Medium so hinzu, dass das Endvolumen 12 Milliliter beträgt und Pipette die Lösung nach oben und unten nach oben und unten zu mischen. Zentrifuge bei 800 mal G für acht Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit 10 Millilitern RPMI-Medium wieder auf. Zentrifugieren Sie wieder bei 750 mal G für acht Minuten. Danach den Überstand entsorgen und das Zellpellet in einem Milliliter PBS auflösen.
Mit einer neuen Bauer-Platte eine Zellzahl durch Mischen von 20 Mikrolitern Probe und 80 Mikroliter einer bis 10 Turk-Lösung bilden. Wenn die nachgelagerte Verarbeitung der Probe nicht für denselben Tag geplant ist, zentrieren Sie die Probe acht Minuten lang bei 750 mal G. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius.
Bereiten Sie zunächst den Primermix mit äquimolaren Mengen jedes Subgruppenprimers vor, um eine unvoreingenommene Verstärkung zu gewährleisten. Mischen Sie die PCR-Reagenzien, wie in Tabelle 2 des Textprotokolls aufgeführt. Fügen Sie 0,5 Mikroliter TAP-Polymerase in die PCR-Röhre mit den gemischten PCR-Reagenzien.
Fügen Sie dann entweder 100 Nanogramm gDNA oder zwei Mikroliter cDNA hinzu. Führen Sie das thermische PCR-Protokoll wie in Tabelle 3 des Textprotokolls beschrieben aus. Danach suchen Sie bei Verwendung der IGHPFR1-Grundierungsmischungen nach PCR-Produkten von ca. 500 Basispaaren, wenn Sie IGHV-Litergrundierungen oder 350 Basispaare verwenden.
Um mit der PCR-Produktreinigung zu beginnen, laden Sie das Gesamtvolumen des PCR-Produkts auf ein drei Prozent schmelzendes Agarosegel. Lassen Sie die PCR-Produkte auf dem Gel laufen, bis sie sich vom Hintergrund trennen. Verbrauchen Sie die scharfen prominenten PCR-Bänder und reinigen und elute sie dann.
Wenn zwei Umlagerungen erkannt werden, sollten beide Bänder getrennt ausgeschnitten und sequenziert werden. Bereinigung von Exo-Sap- und -Bereinigungen befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers in Bezug auf die zu verwendenden spezifischen Volumina. Wirbeln Sie jede Probe sanft, um sie auf einem PCR-Block bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten zu mischen und zu inkubieren.
Inaktivieren Sie die Enzyme, indem Sie sie 15 Minuten lang auf 85 Grad Celsius erhitzen. Danach laden Sie eine kleine Menge der PCR-Produkte auf ein drei Prozent Agarose-Gel, um die Reinheit des Produkts zu beurteilen. Der letzte Prüfpunkt vor der Sequenzierung ist die Bestimmung der Clonalität der Stichprobe mithilfe der Fragmentanalyse.
Starten Sie die entsprechende Software, um mit der Analyse der Sequenz zu beginnen. Geben Sie die Art, z. B. homo sapiens, und den Rezeptortyp oder -ort an. Beschleunigen Sie die Sequenzen, die im Fasta-Format analysiert werden sollen, und schließen Sie Bezeichner in Batches von bis zu 50 Sequenzen pro Durchlauf in den Textbereich ein.
Wählen Sie dann eine der folgenden drei Anzeigeoptionen für die Ergebnisse aus. Detailansicht:Wählen Sie diese Option, um die Ergebnisse für jede Sequenz einzeln zu erhalten. Syntheseansicht:Wählen Sie diese Option aus, um eine Zusammenfassungstabelle nach IGHV-Gen und Allelname oder nach Sequenzeingabereihenfolge zu kompilieren.
Diese Option bietet auch eine Ausrichtung der Sequenzen, die in jedem eingereichten Batch demselben IGHV-Gen und Allel und schließlich der Excel-Datei zugewiesen sind. Wählen Sie diese Option aus, um alle Ausgabedateien als Tabellenkalkulationen bereitzustellen, die in eine einzelne Datei integriert sind. Nur der Einsatz von IGHV-Litergrundierungen ermöglicht die Verstärkung der gesamten Länge des neu angeordneten IGHV und ermöglicht so die Ermittelte der wahren HSM-Last.
Das erwartete PCR-Produkt beträgt ca. 500 Basenpaare. In seltenen Fällen, in denen IGHV-Litergrundierungen die clonotypic IG-Umlagerung nicht verstärken können, können IGHBFR1 Primer verwendet werden. Das erwartete PCR-Produkt beträgt ca. 350 Basenpaare.
Die erhaltenen Sequenzen werden dann mit dem IMG TV Quest-Tool analysiert. In der ersten Zeile in der Ergebnistabelle wird die Funktionalität der Sequenz angezeigt, da eine neu angeordnete Sequenz von IG entweder produktiv oder unproduktiv sein kann. Eine IGH-Gen-Neuanordnung ist unproduktiv, da Stop-Codons entweder innerhalb der VDJ-Region vorhanden sind und/oder wenn die Neuanordnung aufgrund von Einfügungen/Deletionen a-frame ist.
Es ist wichtig zu beachten, dass nur produktive und damit funktionale Umlagerungen weiter analysiert werden sollten. Bei Verwendung der standardmäßigen IMG TV Quest-Parameter werden Einfügungen und Löschungen nicht automatisch erkannt, jedoch werden starke Hinweise darauf, dass eine Sequenz solche Änderungen mit sich bringen kann, vom Tool bereitgestellt und eine Warnwarnung wird unter der Ergebniszusammenfassungstabelle angezeigt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die PCR-Produkte lange genug auf dem Gel zu landen, damit die klonale Bindung vom polyklonalen Hintergrund diskriminiert werden kann.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der chronischen lymphatischen Leukämie-Immungenetik, um die prognostischen Auswirkungen des somatischen Epimutationsstatus bei Patienten zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ethylbromid extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit unter der Haube zu jeder Zeit sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
