Die Entwicklung von Techniken zur Untersuchung des Transports von Makromolekülen zwischen dem Kern und dem Zytoplasma und die Identifizierung einer Fehllokalisierung von Tumorsuppressorproteinen ist unerlässlich, um ein tieferes Verständnis der CLL-Pathogenese zu gewinnen und bei der Entwicklung neuartiger Therapien zu helfen. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und effiziente Methode zur Erzeugung nuklearer und zytoplasmatischer Fraktionen aus primären CLL-Zellen. Diese Fraktionen können in nachgeschalteten Experimenten wie Enzymaktivitätstests, proteomischer Analyse und westlicher Blotting verwendet werden.
Diese Technik wird unser Verständnis davon erweitern, wie Therapien und Mikro-Umweltsignale innerhalb von Tumoren die Abschottung von Proteinen zwischen Dem Zellkern und Zytoplasma in CLL-Zellen und potenziell anderen B-Zell-Malignomen verändern. Diese Methode kann verwendet werden, um die Position von Proteinen zu bestimmen und/oder Proteinbewegungen anzuziehen. Führen Sie einen Waschmittelgradienten auf jeder einzelnen Zelllinie durch, die Sie verwenden möchten, um die optimale Erzeugung hoch angereicherter Kern- und Zytoplasmafraktionen zu gewährleisten.
Neben Jodie Hay und Michael Moles wird Jennifer Cassels, eine Technikerin aus meinem Labor, dieses Verfahren demonstrieren. Erhalten Sie periphere Blutproben von zuvor genehmigten patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie in EDTA-Blutentnahmeröhrchen, begleitet von der Anzahl der weißen Zellen. Menschliche Blutproben sollten als gefährlich angesehen werden, da sie potenziell blutübertragene Viren enthalten.
Bitte stellen Sie sicher, dass diese Proben in einem Biosicherheitsschrank der Klasse 2 behandelt werden und dass der Benutzer jederzeit einen Labormantel und Handschuhe trägt. Entsorgen Sie blutverunreinigte Materialien in Desinfektionsmitteln. Wenn die Anzahl der weißen Zellen gleich oder größer als 40 Millionen Zellen pro Milliliter ist, verdünnen Sie die Probe im Verhältnis eins zu eins mit dem RT CLL-Waschpuffer.
Dann aliquot RT Dichte Gradient mittel in eine entsprechend große konische Zentrifugenrohr für die Probe. Die Probe bei RT vorsichtig auf das Medium und Zentrifuge bei 400 x g schichten. Mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff ernten Sie vorsichtig die weiße Schicht mononukleären Zellen, die sich an der Schnittstelle des Dichtegradientenmediums im CLL-Waschpuffer sammelt. Übertragen Sie diese isolierte Monoschicht in ein frisches 50-Milliliter-Konzentrifugenrohr.
Um die Zellen zu waschen, fügen Sie 40 Milliliter CLL-Waschpuffer zu dieser Monoschicht und Zentrifuge bei 300 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur hinzu. Entsorgen Sie den Überstand, streichen Sie den Boden des Rohres, um das Pellet wieder aufzuhängen, und wiederholen Sie diese Wäsche. Entsorgen Sie den Überstand, streichen Sie erneut mit dem Boden des Rohres, und hängen Sie das Zellpellet in einem festgelegten Volumen von CLL-Waschpuffern in Abhängigkeit von der Größe des Pellets wieder auf.
Nach dem Zählen der Zellen und nach dem Durchfluss Zytometrie, um die Zellreinheit zu überprüfen, legen Sie die Zellen in Gewebekulturplatten bei der erforderlichen Zelldichte bereit für die Stimulation oder medikamentöse Behandlung. Nach der Stimulation und/oder medikamentösen Behandlung ist die Inkubation abgeschlossen. Übertragen Sie die Zellen in individuell beschriftete 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhren und Pellets durch Zentrifugieren bei 200 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Zellpellet in einem Milliliter eiskaltem PBS mit Phosphatase-Inhibitoren wieder aufhängen. Zentrifuge bei 200 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und halten Sie diese ganzen Zellextraktpellets auf Eis für weitere Vorbereitungen.
Um zytoplasmatische Fraktionen vorzubereiten, setzen Sie die Zellpellets vorsichtig in 50 Mikrolitern des 1x hypertonischen Puffers wieder auf. Damit die Zellen anschwellen können, bebrüten Sie sie 15 Minuten lang auf Eis. Nach einer Ausführung eines Waschmittelgradienten zur Bestimmung der optimalen Konzentration des Waschmittels für einen bestimmten Zelltyp, fügen Sie 0,8 bis 2,5 Mikroliter Waschmittel in jede Probe und Wirbel auf der höchsten Einstellung für 10 Sekunden hinzu.
Um die Zelllyse zu überprüfen, beobachten Sie die Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop vor und nach Zugabe von Reinigungsmittel. Alle Zellen haben einen dichten, dunklen Kern, der vom Zytoplasma umgeben ist, das als heller Halo erscheint. Einmal lysiert, zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 x g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius.
Ohne das Pellet zu stören, den Überstand vorsichtig in ein vorgekühltes, markiertes Mikrofugenrohr zu geben und diese zytoplasmatische Fraktion bis zu einer weiteren Analyse bei 80 Grad Celsius zu lagern. Stellen Sie die vollständige Entfernung der zytoplasmatischen Fraktion sicher, um eine Kontamination der Kernfraktion zu verhindern. Zum verbleibenden Pellet, das die Kernfraktion enthält, 50 Mikroliter vollständiger Lysepuffer hinzufügen und durch Pipettieren nach oben und unten wieder aufhängen.
Um Proteine, die mit der Kernmembran verbunden sind, zu löslich, fügen Sie 2,5 Mikroliter Waschmittel hinzu, wirbeln Sie 10 Sekunden lang auf der höchsten Einstellung und brüten sie 30 Minuten lang auf Eis. Wirbel auf der höchsten Einstellung für 30 Sekunden und Zentrifuge. Dann den Überstand in ein vorgekühltes mikrofugiertes Rohr geben und diese Kernfraktion bis zu einer weiteren Analyse bei 80 Grad Celsius lagern.
Für ganze Zelllysate, re-suspend die ganze Zelle Extrakt Pellets in 100 Mikroliter vollständiger Lyse Puffer durch Pipettieren nach oben und unten. Um eine vollständige Zelllyse zu gewährleisten, fünf Mikroliter Waschmittel hinzufügen und 30 Minuten auf Eis brüten. Wirbel auf der höchsten Einstellung für 30 Sekunden und dann Zentrifuge bei 14.000 x g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.
Übertragen Sie den Überstand in ein vorgekühltes Mikrofugenrohr und lagern Sie das ganze Zelllysat bei 80 Grad Celsius bis zu einer weiteren Analyse. Um den Proteinhandel zwischen nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionen zu quantifizieren, führen Sie quantitative Western-Blot-Analysen durch und importieren Sie die Bilder. Um das Bild im Bildband anzuzeigen, klicken Sie auf die Schaltfläche Auswählen in der Anzeigegruppe und klicken Sie auf Chemi-Kanal.
Das Dialogfeld Anzeige auswählen wird geöffnet, um bei Bedarf weitere Anpassungen zu ermöglichen. Implementieren Sie zusätzliche Verbesserungen mit den einstellbaren Schiebereglern auf der Registerkarte des LUT des Bildes, einschließlich Helligkeit oder Kontrast. Verwenden Sie die Registerkarte Kurven für feinere Anpassungen.
Für die Datenanalyse klicken Sie zuerst auf das Menüband Analyse. Um nur einen Kanal zu analysieren, deaktivieren Sie die Nicht-Analyse-Kanäle, indem Sie auf die Miniaturansicht "Kanal anzeigen" eines Kanals klicken, sodass nur der gewünschte Kanal angezeigt wird. Um die Signalintensität zu quantifizieren, klicken Sie auf Rechteck hinzufügen, um dem Bild Rechtecke hinzuzufügen.
Klicken Sie auf die Mitte eines Features, z. B. auf ein Proteinband, um ein Rechteck um das Feature zu legen. Nachdem Sie die gewünschten Shapes hinzugefügt haben, klicken Sie auf Auswählen, um den Cursor zum Auswahlwerkzeug zurückzukehren. Um Hintergrundgeräusche zu subtrahieren, klicken Sie auf die erste Schaltfläche in der Hintergrundgruppe, und wählen Sie Median aus dem Dropdown-Menü aus.
Legen Sie die Rahmenbreite im Dialogfeld Hintergrund auf drei fest, und wählen Sie die Segmente aus, die den Bildhintergrund am besten darstellen, der für die Hintergrundberechnung verwendet werden soll. Um die Daten zu exportieren, klicken Sie auf die Registerkarte Shapes über der Tabelle. Für die Densitometrie sind Werte in der Signalspalte erforderlich.
Signal ist die Summe der Pixelintensitätswerte oder summe für eine Form abzüglich des Produkts des Hintergrunds im Bereich. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Bericht, klicken Sie auf Speichern unter oder Tabellenstart. Um die normalisierte Expression des Proteins von Interesse für jede Ebene oder Variable innerhalb der gespeicherten Tabelle zu berechnen, dividieren Sie das erhaltene Signal für das Protein von Interesse durch das Signal für das entsprechende Protein-Ladekontrollband.
Um das Bild zu exportieren, klicken Sie auf die Registerkarte Bilder, die sich über der Tabelle befindet, und klicken Sie dann auf das zu exportierende Bild. Wenn Sie das Bild für eine Folienpräsentation oder andere digitale Formate verwenden, klicken Sie auf das Softwaresymbol, zeigen Sie mit der Maus auf Exportieren, klicken Sie auf Bild für digitale Medien, und speichern Sie das Bild dann nach Bedarf. Die Anreicherung von CLL-Zellen mit einem WCC von mehr als 40 Millionen pro Milliliter durch Dichtezentrifugation ermöglicht eine hohe Zellrückgewinnung.
Die Analyse der Probe durch Durchflusszytometrie nach Demgating auf FSC und SSC ergab, dass die Reinheit der CLL-Zellen mehr als 95 % beträgt, wie die doppeloberflächenfreie Expression von CLL-Zellmarkern, CD19 und CD5 zeigt. Wenn Immunflecken an den resultierenden Fraktionen der CLL-Zelllinie, Mac-1 und primären CLL-Zellen durchgeführt wurden, zeigte die Fraktionierung an, dass der optimale Waschmittelspiegel für Mac-1-Zellen bei einer bis 60 Verdünnung lag, verglichen mit eins bis 30 für primäre CLL-Zellen. Als die subzelluläre Lokalisation von FOXO1 in kern- und zytoplasmatischen Fraktionen in Mac-1- und primären CLL-Zellen bestimmt wurde, wurde die Erzeugung hoch angereicherter Fraktionen durch die fast ausschließliche Expression von Lamin in der Kern- und Beta-Tubulin in den zytoplasmatischen Fraktionen gezeigt.
Die FOXO1-Expression wurde im Zytoplasma nach der Behandlung mit AZD 8055 im Vergleich zu NDC reduziert, begleitet von einer Erhöhung der FOXO1-Expression im Kernkompartiment, wodurch die Proteintranslokation nachgewiesen wurde. Nachdem einzelne Immunflecken aus fünf primären CLL-Proben innerhalb subzellulärer Fraktionen quantifiziert wurden, wurde azD 8055 gefunden, um die FOXO1-Expression im Zytoplasma zu reduzieren und die Expression im Zellkern zu erhöhen. BCR-Vernetzung erhöhte zytoplasmatische FOXO1-Expression.
Denken Sie daran, alle Reagenzien und Proben auf Eis zu halten, um den Proteinabbau zu verhindern. Die in diesem Verfahren erzeugten subzellulären Fraktionen können auch in Enzymaktivitätstests wie einem FOXO-Aktivitätstest verwendet werden, der es ermöglicht, Parallelen zwischen dem zellulären Standort von FOXO1 und seiner DNA-Bindungsaktivität zu ziehen. Die Entwicklung dieser Technik hat es uns ermöglicht, den Handel mit spezifischen Proteinen innerhalb von CLL-Zellen als Reaktion auf selektive Inhibitoren anzugehen und unterstützt unsere parallelen Immunfluoreszenzstudien, um einen robusten und quantifizierbaren Datensatz zu generieren.
