Die Integration dieser Methode mit Tropfen-basierter Mikrofluidik hilft, Schlüsselfragen im Bereich der Systemimmunologie zu beantworten, um die zelluläre Heterogenität und kommunikation zwischen einzelnen Zellen oder Krankheitserregern zu kodieren. Der Hauptvorteil dieser Von uns entwickelten Technik besteht darin, dass dieses Spitzenladeverfahren die Verkapselung seltener Zellen in Tröpfchen ermöglicht, die eng mit der vorhergesagten Prozentualen Verteilung übereinstimmen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um zu verstehen, wie Pipettenspitzen verwendet werden, um Zellen in geschlechtsspezifische Tröpfchen zu laden und Zellen aus den Tröpfchen abzurufen.
Für die Spitzenbelastung für wässrige Tröpfchenerzeugung zunächst drei Milliliter Tensid zu zwei Millilitermehlöl geben und das Ölphasengemisch in eine 2,5-Milliliter-Spritze ziehen. Entfernen Sie alle Luftblasen aus der Spritze und schließen Sie die Spritze an ein Stück Teflonschlauch mit entsprechender Länge an. Zwei Probenspritzen mit einem geeigneten bikompatiblen Mineralöl beladen und mit einem zweiten Stück Teflonschlauch in geeigneter Länge verbinden.
Als nächstes stanzen Sie einen Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Stecker mit einem Durchmesser von fünf Millimetern aus einer ausgehärteten EDMS-Platte und schlagen Sie ein Loch von einem Millimeter durch die Mitte des Steckers. Stecken Sie den Stecker fest in das obere Ende einer 200-Mikroliter-Pipette-Spitze und legen Sie den Schlauch, der an der bikompatiblen Mineralölspritze befestigt ist, in den Stecker. Drücken Sie den Spritzenkolben langsam, um die Pipettenspitze mit Mineralöl zu füllen, das die gesamte Restluft herausschiebt.
Legen Sie sowohl probenspritzen als auch die mehlierte Ölspritze vorsichtig auf eine Spritzenpumpe. Wenn die gesamte Luft entfernt wurde, senken Sie jede Pipette-Spitze in die Probenlösung und aspirieren Sie etwa 100 Mikroliter Zellprobe in die Spitzen. Als nächstes legen Sie beide probenhaltigen Pipettenspitzen in die beiden inneren Einlässe des PDMS-Chips ein und legen Sie das Rohr, das das Ölphasengemisch enthält, in den äußeren Einlass ein.
Stellen Sie die Durchflussraten auf der Spritzenpumpe wie angegeben ein und geben Sie die Abmessungen jeder Spritze ein und legen Sie sie fest. Starten Sie die Pumpe, um die Probenlösung durch die inneren Kanäle des Geräts und die Ölphase durch den äußeren Kanal des Geräts zu spülen. Stecken Sie dann ein Stück Schlauch mit einer entsprechenden Länge in den Auslass, um mit dem Sammeln der Tröpfchen zu beginnen, wenn die Tröpfchenbildung stabil ist, und sammeln Sie die Tröpfchen in einem Schleusenrohr.
Wenn alle Tröpfchen gesammelt wurden, fügen Sie 200 Mikroliter RPMI-Medium, ohne Serum, auf die Tröpfchen und inkubieren Sie die Probe mit dem Loch auf dem Deckel des Verriegelungsrohrs für den entsprechenden experimentellen Zeitraum. Zum Emulsionsbruch zunächst zwei Milliliter PFO zu acht Millilitern flouiniertem Öl hinzufügen und eine Spritze verwenden, um das überschüssige Öl von der Unterseite des Tröpfchensammelrohrs zu entfernen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter 20%PFO-Lösung in die Emulsion, um die gekapselten Zellen in die wässrige Phase freizusetzen, und tippen Sie kurz auf das Rohr, um es zu mischen.
Vergessen Sie nicht, dass PFO schädlich für die Zellen sein kann. Und halten Sie daher den Kontakt mit PFO auf ein Minimum. Drehen Sie die Lösung nach ein bis zwei Minuten 30 Sekunden lang mit der geringstmöglichen relativen Fliehkraft und übertragen Sie sofort 550 Mikroliter der wässrigen Fraktion in ein neues verschlossenes Rohr mit 500 Mikroliter kalten PBS, ergänzt durch 2%Fetal Calf Serum, oder FCS.
Lassen Sie jedes Restöl auf den Boden des neuen Schleusenrohrs sinken und übertragen Sie vorsichtig 950 Mikroliter der Zelle, die wässrige Phase enthält, auf ein neues Schleusenrohr. Stellen Sie sicher, dass das Öl nicht zusammen mit der wässrigen Phase in das neue Schleusenrohr übertragen wird. Dann sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 300 Mikroliter frisch kalte PBS ergänzt mit 2%FCS.
Mit dem soeben demonstrierten Tip-Ladeansatz können Jurkat T-Zellkapselungsraten ermittelt werden, die mit den statistisch vorhergesagten Werten zusammenfallen. Bemerkenswert ist, dass selbst bei anhaftenden Zellen wie Tumorzellen, die zu Klumpen neigen, oder seltenen Zellen wie plasmazytoiden dendritischen Zellen eine verbesserte Verkapselungseffizienz beobachtet wird. Während dieser repräsentativen Verkapselung regenerierten sich die Tröpfchen mit ultraniedriger Geliertemperatur-Agarose und gelierten nach der Produktion zu Agarose-Hydrogelperlen, die eine nachfolgende nachgeschaltete Analyse mittels Mikroskopie und Durchflusszytometrie ermöglichten.
Die mikroskopische Analyse ergab, dass die Zellpaarung bei verschiedenen Kombinationen indikativ für die Zellpaarung mit hohem Durchsatz und die Analyse der gleichen Population von Hydrogelperlen durch Durchflusszytometrie durchgeführt wurde, was ergab, dass Perlen ohne Zellen von den Perlen mit Zellen auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen vorwärts- und seitlichen Streumuster getrennt werden konnten. Tatsächlich bestätigte die Gating auf die Population von Perlen ohne Zellen einen Mangel an Zellverkapselung durch das Fehlen von fluoreszierenden Signalen, während das Gating auf die Perlenpopulation mit Zellen die Existenz mehrerer Subpopulationen zeigte, die auf die Verkapselung unterschiedlich gekennzeichneter Jurkat-T-Zellen hindeuten. Bei der Arbeit mit dieser Methode ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Zellkonzentration ein begrenzender Faktor ist und optimiert werden muss, um eine effiziente Zellkapselung und Zellpaarung zu sicherstellen.
Nach diesem Verfahren können nicht nur ein oder zwei Zellen in Tröpfchen mit hoher Effizienz gekapselt werden, sondern mehrere Zellen oder Zelltypen können für eine genauere Replikation der zellulären Mikroumgebung gekapselt werden. Diese Technik wird den Weg für Forscher in den Bereichen Immunologie und verwandte Disziplinen für eine optimale Nutzung von Narbenzellpopulationen und deren effiziente Verkapselung in Tröpfchen ebnen, um das zelluläre Verhalten in einer geräuschfreien Umgebung zu untersuchen.
