Wir bedanken uns bei Ella Weinert, Michelle Helms und Marlis Badusche für hervorragende technische Unterstützung, Jessica Börstler für Analysen von Culex -Mücken, Norbert Becker und Björn Pluskota für die Bereitstellung von Aedes Albopictus Eier und Olli Vapalahti für Bereitstellung den Virus bestand. ML wurde von der Leibniz-Gemeinschaft unterstützt; Nummer Säge-2014-SGN-3 zu gewähren.

1. bereiten Sie weibliche Stechmücken
<ol><li>Sammeln Sie Mücken aus ein großer Käfig mit einer Absauganlage (ca. 400 Mücken pro großer Käfig).</li>
	<li>Betäuben Sie die Mücken mit Kohlendioxid (CO2) für 7 s.</li>
	<li>Sortieren Sie 20 Weibchen pro Kunststoff Vial (Ø 50 mm × 100 mm). Hinweis: Wenn die Mücken aufwachen, verwenden Sie weitere 3 s Co2.
</li>
	<li>Verhungern Sie die Mücken über Nacht.</li>
</ol>2. künstliche Blutmahlzeit
Hinweis: Alle Schritte sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>
Bereiten Sie die infektiöse Blutmahlzeit.
	<ol>
<li>Verdünnen Sie den Virus bestand, die Konzentration von 1 x 108 Plaque bilden Einheiten (PFU) / mL. Hinweis: Die Lager Konzentration wurde bestimmt durch Gewebekultur Infektion Dosis 50-Methode (TCID50) ausführen und berechnet, indem die Spearman & Kärber Algorithmus10,11.</li>
		<li>Mix abgelaufen menschliches Blut (Blut-Erhaltung) von der Blutbank (nicht geeignet für Menschen mehr, aber nützlich für die Mücken) mit Fruchtzucker (8 % ige Lösung), filtriert, bovine Serum (FBS) und funktionierende Lösung des Bestands Virus (menschliches Blut: Fruktose: FBS abgelaufen: Arbeitslösung = 5:3:1:1). Hinweis: Wir entschieden uns für menschliches Blut, denn dies ist der bekannte natürliche Säugetier-Gastgeber des ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>140 µL Blutmahlzeit Mix zur weiteren Analyse über TCID50 einfrieren.</li>
	<li>
Führen Sie die künstliche Ernährung mit verschiedenen Fütterung Methoden, abhängig von der Sorte:
	<ol>
<li>
Aedes Aegypti: verwenden eine Membran Fütterungssystem für 30 min (1 mL pro Feeder).</li>
		<li>
Culex spp.: bieten die ansteckende Blut über ein Wattestäbchen über Nacht und nicht das Blut (300 µL pro Fläschchen) Aufwärmen.</li>
		<li>
Aedes Albopictus: zwei Tropfen (50 µL) der Blutmahlzeit Mischung in die Kunststoff-Flasche und lassen die Moskitos für 2 h füttern. Das Blut nicht Aufwärmen. Hinweis: Die Mücken werden in den ersten 15 min einfließen. Die längeren Inkubationszeit ist aus Sicherheitsgründen notwendig. Die Tröpfchen Blut abgelassen nach 2 h, damit das Kontaminationsrisiko reduziert wird, während die Sortierung der Mücken gefüttert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Betäuben Sie die Mücken mit CO2 für 7 s. Hinweis: Wenn die Mücken aufwachen, verwenden Sie weitere 3 s CO2.</li>
	<li>Art und Anzahl voll gestaut Mücken in ein neues Fläschchen.</li>
	<li>Fügen Sie ein Wattepad, gesättigt mit Fruchtzucker (8 % ige Lösung) zwischen das Fläschchen und ein Stecker.</li>
	<li>Halten Sie die Mücken an der vorgesehenen Temperatur von 18 ° C und 27 ° C in der Luftfeuchtigkeit von 80 % für 14 oder 21 Tage.</li>
	<li>Füttern Sie die Mücken mit Fruktose gesättigte Wattepads. Alle 72 h mit Fruktose (8 % ige Lösung) pro Fläschchen 1,5 mL Auffüllen (bis zu 20 Mücken, abhängig von der Fütterung bewerten, siehe Punkt 2.5).</li>
</ol>(3) gezwungen Speichelfluss Assay an Tag 14 oder 21
Hinweis: Alle Schritte sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>2 x 104 Vero-Zellen Seed / pro Bohrloch in ein 96 sowie Platte mit 200 µL Wachstumsmedium (Dulbecco´s modifiziert Eagle Medium (DMEM) mit 3 % FBS, 100 U/mL Penicillin, 100 mg/mL Streptomycin, 5 µg/mL Amphotericin B, 2 mM L-Glutamin ergänzt 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1 % Natrium Pyruvat).</li>
	<li>
Bereiten Sie das Speichelfluss-Gerät:
	<ol>
<li>Legen Sie eine quadratische Glasplatte (20 × 20 cm) auf der Bank in einem Winkel von 30°. Hinweis: Dies ist notwendig, da der Unterdruck im Sicherheitslabor. Wenn die Platte horizontal oder vertikal, wird Flüssigkeit austreten.</li>
		<li>Legen Sie doppelseitiges Klebeband auf die Glasplatte.</li>
		<li>Rolle der Modelliermasse bis es erreicht einen Durchmesser von 0,5 cm und horizontal 1 cm entfernt von dem doppelseitigen Klebeband befestigen.</li>
		<li>Die ersten 0,3 cm von der Spitze der eine 10 µL Filterspitze abgeschnitten. Hinweis: Es empfiehlt sich, dies vor Beginn des Experiments außerhalb des Biosafety Labors vorzubereiten.</li>
		<li>Füllen Sie die Filter-Tips mit 10 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Legen Sie die Filter-Tips auf die Modelliermasse mit der Spitze in Richtung der Klebeband.</li>
		<li>Sichern Sie die Filter-Tips mit sanftem Druck.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie die Mücken:
	<ol>
<li>Die Mücken mit CO2zu betäuben.</li>
		<li>Entfernen Sie die Beine und Flügel, die Mücken zu immobilisieren.</li>
		<li>Befestigen Sie die Mücke lebenden Körper auf Klebeband über eine Filterspitze.</li>
		<li>Legen Sie den Rüssel sanft in die Filterspitze.</li>
		<li>Laufen Sie den Speichelfluss Test für 30 min.</li>
		<li>Entfernen Sie die Filter-Tips und entsorgen Sie der Lehm und Band.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Verarbeitung von Speichel
Hinweis: Schritte 4.1 – 4.6.2 sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>Vertreiben Sie den Inhalt in die Reaktionsgefäße mit 10 µL PBS.</li>
	<li>Mischen Sie vorsichtig und übertragen Sie die Inhalte in die Vertiefungen der vorbereiteten 96-well-Platte mit einem Brunnen pro Probe.</li>
	<li>7 Tage bei 37 ° C mit 5 % CO2inkubieren Sie Platte.</li>
	<li>Verwenden Sie das Fernglas, um die Zellen auf das Vorhandensein von Zytopathischer Effekt (CPE) überprüfen.</li>
	<li>Wenn die nun positiv für CPE, Ernten des Überstands durch pipettieren 140 µL in einem Reaktionsgefäß für RNA-Extraktion.</li>
	<li>
Reinigen Sie die RNA mittels einer RNA-Extraktion-Kit.
	<ol>
<li>Mix-140 µL des Überstands mit 560 µL AVL Puffer (virale Lyse Puffer) und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Hinzufügen von 560 µL Ethanol (96 %) und Wirbel der Probe. Hinweis: Die Proben sind nach diesem Schritt deaktiviert und aus dem Labor BSL-3 abgeführt werden können.</li>
		<li>Pipettieren 630 µL der Probe auf eine Spalte und Zentrifuge mit 6.000 x g für 1 min.</li>
		<li>Verwerfen Sie das Filtrat, pipettieren der verbleibenden 630 µL auf die Spalte zu und wiederholen Sie die Zentrifugation.</li>
		<li>Waschen der RNS, gebunden an die Membran der Spalte, durch Zugabe von 500 µL Waschpuffer 1 Spalte und Zentrifuge bei 6.000 X g für 1 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie das sammelröhrchen und legen Sie die Spalte in eine neue Kollektion-Röhre. Fügen Sie 500 µL waschen Puffer 2 und Zentrifuge bei 12.500 X g für 3 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie das sammelröhrchen und legen Sie die Spalte in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß.</li>
		<li>Fügen Sie 50 µL der Elution Buffer und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Bei 6.000 X g für 1 min zentrifugieren Sie und verwerfen Sie die Spalte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Proben für ZIKV RNA durch RT-qPCR analysieren.</li>
</ol>5. Bearbeitung von Mosquito Körper
Hinweis: Die Schritte 5.1-5.5 sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>Entfernen Sie der Körper des Moskitos und jeder Körper in einem Reaktionsgefäß. Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL der Homogenisierung Medien (DMEM ohne irgendwelche Nahrungsergänzungsmittel) in das Reaktionsgefäß.</li>
	<li>Homogenisieren Sie den Körper mit motor Handmixer zu und verwenden Sie einen neuen Stempel für jede Probe.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Das Homogenat in eine 96-Well-Platte für die Reinigung. Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.</li>
	<li>Deaktivieren Sie die Platte durch Inkubation für 60 min bei 60 ° C.</li>
	<li>Reinigen Sie die RNA durch automatisierte Nukleinsäure-Reinigung. Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>6. Analyse
<ol><li>Die virale RNA-Kopien mit RT-qPCR zu quantifizieren. Hinweis: Die RNA-Kopien wurden gemittelt über alle ZIKV-positiven Moskito Körper und ohne Einbeziehung der ZIKV-Negative Mücken.</li>
	<li>Berechnen Sie die IR, definiert als die Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper pro Anzahl der Weibchen gefüttert.</li>
	<li>TR, definiert als die Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper zu berechnen. Die Übertragungsrate konnte nicht für Arten-Temperatur-Kombinationen mit keine ZIKV-positiven Körper berechnet werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus.">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li><li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus.">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 463 (2015).</li><li>Weger-Lucarelli, J., R&#252;ckert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., Turell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).</li><li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes:+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection.">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Bisher hat sich gezeigt, dass klassische neu Fütterung Experimente6Ergebnisse mit erzwungenen Speichelfluss entsprechen. Jedoch ist wieder Fütterungsversuche sowohl in unsere vorgestellte Methode der erzwungenen Speichelfluss, es unmöglich, direkt Nachweis Speichelfluss Aktivität oder die Freisetzung von Speichel zu überwachen. Um Speichelfluss Aktivität zu beweisen, konnte Proben getestet werden, für andere Komponenten im Speichel vorhanden (zB., Proteine, Kohlenhydrate, etc..). Darüber hinaus könnten zusätzliche qPCRs Nachweis von viraler RNA-Kopien. Dies erfordert allerdings, Spaltung der Speichelproben für verschiedene Analysen, die Empfindlichkeit in der Zelle Kultur Test bei sehr niedrigen Partikelanzahl begrenzen können. Im Gegenzug könnte dies zu einer Unterschätzung des ermittelten Übertragungsraten.
Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen ist es notwendig, um sicherzustellen, dass alle Mücken bis zum Ende des Experiments am Leben zu bleiben. Dies wird gesteuert, indem Sie visuell überwachen den Körper Bewegungsaktivität der Moskitos. Darüber hinaus hat die Prinzip Verwendung des Speichelfluss Assays für einen bestimmten Mückenarten getestet werden, durch die Fütterung von Kontrolle-Viren, die bekannt sind, durch diese bestimmte Mückenarten übertragen werden. Umgekehrt, hat jeder Virus erstmals in einem Experiment in einer anfälligen Mücke getestet werden.
Erzwungene Speichelfluss Assays haben viele Vorteile. Hohe Anzahl von Mücken können gleichzeitig auf einem einzigen Exemplar unter kontrollierten standardisierten Bedingungen getestet werden, ohne dass Konflikte mit Tierschutz Vorschriften9.
Die Methode wird von mehreren Labors verwendet. Genaue Einstellungen können jedoch abweichen, um Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Labors führen kann. Eine wichtige Komponente ist die Kapillare, den Speichel zu sammeln, die von Glas14 oder Kunststoff15erfolgen kann. Zur Einhaltung der hohen Sicherheitsbestimmungen ein Biosafety Level 3 Insectary benutzten wir Kunststoff Filterspitzen anstelle von Glaskapillaren, wodurch das Risiko von Verletzungen. Filter-Tips haben darüber hinaus den Vorteil, dass die gesammelte Flüssigkeit mit einer Pipette leicht übertragen werden kann.
Das Setup des hier vorgestellten erzwungene Speichelfluss Assays beruht auf zwei Ermittler arbeiten zusammen und teilen Aufgaben. Demobilisierung der Mücke wird von einer Person durchgeführt, während die andere gleichzeitig das erzwungene Speichelfluss Setup bereitet. Dies reduziert die Bearbeitungszeit erheblich und minimiert das Risiko der Probe Schalter als Wechsel zwischen der Demobilisierung-Arbeitsplatz und den Speichelfluss-Platte ist nicht notwendig. Darüber hinaus erlaubt es die Mücken auf dem erzwungenen Speichelfluss Gerät sofort nach der Demobilisierung platzieren. Diese eher kurze Mücke Bearbeitungszeit ist entscheidend für erfolgreiche erzwungene Speichelfluss. Schließlich können die Mücken direkt auf Motilität in das ganze Experiment überwacht werden.
Die hier vorgestellten Speichelfluss-Assay wird verwendet, um Einblicke in das Vektor-Potenzial der Mückenarten. Jedoch, einige konkreten Fragen zu beantworten (zB., die Zahlen von Mückenstichen, die erforderlich sind, um Wirbeltiere infizieren), tierische Experimente noch erforderlich sein könnten.

In 2015, Zika-Virus (ZIKV), assoziiert ein Moskitos übertragene Virus (Mobovirus) aus der Familie , die Flaviviridae, in Kolumbien und Brasilien entstand und verbreitete sich rasch in ganz Nord-und Südamerika und der Karibik, verursacht eine Epidemie mit einer bemerkenswerten Anzahl von klinische Fälle von Mikrozephalie und Guillain-Barré-Syndrom1. Stechmücken der Gattung Aedes Aegypti und Aedes Albopictus gelten die primären und sekundären Vektoren von ZIKV2, aber andere Arten der Gattung Aedes haben auch bewiesen, experimentelle vektorkompetenz3 haben . Im Gegensatz zu den Aedes -Arten sind die meisten der Gattung Culex getestet bisher nicht in der Lage, das Virus4übertragen. Bloß, lieferten die Daten für Culex Quinquefasciatus eindeutigen Ergebnisse3. Derzeit fehlen Informationen über Moskito vektorkompetenz für ZIKV bei moderaten Temperaturen (< 20 ° C). Diese Information ist jedoch wesentlich für die Risikobewertung von möglichen Spreads in Regionen mit gemäßigtem Klima wie Mitteleuropa.
Ein kompetenter Vektor für ZIKV ist in der Lage zu erwerben, zu erhalten, zu verstärken und schließlich das Virus übertragen. Deshalb testen die Mücke Organe oder Körperteile, wie Beine, Mitteldarm, Kopf oder Speicheldrüsen, für ZIKV nicht ausreichen, um vektorkompetenz bestimmen. Es ist obligatorisch, infektiösen Viruspartikeln in freigegebenen Speichel testen. Zur Beurteilung vektorkompetenz müssen Infektionsrate (IR, Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper pro Anzahl der engorged Mücken) und Übertragungsrate (TR, Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper), bestimmt. IRs Mücken kann leicht durch einfach homogenisierende Mücken gefolgt von eine Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) analysiert werden gezielt ZIKV. Darüber hinaus kann die Infektion weiter charakterisiert werden, durch die Bestimmung der viralen heftnummern pro Mücke. Im Gegensatz dazu setzt die Analyse der Übertragungsraten auf die Erkennung von lebensfähigen Viruspartikel im Speichel der einzelnen Mücken. Dies kann erreicht werden durch die Fütterung von infizierten Mücken auf empfänglichen Wirtstiere, gefolgt von der Analyse der Virämie in der Host-5. Jedoch diese Methode stützt sich auf geeignete Modellorganismen und ist kostspielig und durch Tierschutz Vorschriften beschränkt. Um den Einsatz von Versuchstieren für die Analyse von Übertragungsraten zu vermeiden und Kosten zu senken, beschrieben künstliche neu Zuführsysteme mit Blut Tropfen wurden6. Prüfung auf individuellen Ebene kombiniert mit einer hohen Anzahl von Personen ist jedoch schwierig und zeitaufwändig. Die erste Beschreibung eines Speichelfluss Assays auf individueller Ebene erschien 19667 und erzwungene Speichelfluss Experimente geworden in den letzten Jahren die Methode der Wahl, die vektorkompetenz von Stechmücken3,8 zu bewerten .
Basierend auf unsere Vektor-Kompetenz-Studie der mitteleuropäischen Mücken veröffentlichte vor kurzem9, beschreiben wir gezwungen Speichelfluss, wie Anderson Et al.berichtet. 8 mit einigen Änderungen. Diese Methode ermöglicht hoher Durchsatz standardisiert Experimente Bedingungen hohe Biosafety Niveau (BSL-3) und umfasst die Ermittlung des aktiven Virus durch Zelle Kultur basierte Assays. Die hier beschriebenen Experimente gehören 856 Mücken. Sie waren mit ZIKV durch künstliche Blutmahlzeit angesteckt und anschließend auf das Vorhandensein von infektiösen Viruspartikeln im Speichel analysiert. Die Mücken in die Experimente bestand aus zwei alteingesessenen Labor Populationen von Ae. Aegypti und Culex Pipiens Pipiens Biotyp Molestus (Cx. p. Molestus) sowie Feld eingeführt gefangen Culex Pipiens Pipiens Biotyp Pipiens (Cx. s. Pipiens), Culex Torrentium (Cx. Torrentium) und zwei Ae. Albopictus Populationen. Mit Ausnahme von einem der beiden Ae. Albopictus Populationen, die in Italien gesammelt wurde, wurden alle Mücken in Deutschland gesammelt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inject+matic Sleeper</td>
			<td>Inject+matic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td>
			<td>BugDorm Store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK11.2</td>
			<td>plastic vial for mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug for drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK15.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant climate chamber</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KBF-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont-Pincette Electronic SS</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>B40c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>BNITM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flash light aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td>
			<td>Ansell</td>
			<td></td>
			<td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td>
			<td>altona diagnostics</td>
			<td>591013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>4462359</td>
			<td>RNA isolation of mosquito bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52906</td>
			<td>RNA-Isolation of supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips (20 &#181;L)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>701,116,210</td>
			<td>Cut the first 3 mm of the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>sold out</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro pestles for hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>CXH8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td>P0403550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P06-0110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>4981.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0443100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NAA</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0832100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek Feeder</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler Software</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 SW 1.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King Fisher Flex Purification System</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes albopictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>SMZ-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular light</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>MLC-150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

Vektorkompetenz ist definiert als das Potenzial einer Mückenarten Moskitos übertragene Virus (Mobovirus) zu einem fest gefügten Host übertragen. Tragfähige Viruspartikel sind während einer Blutmahlzeit über den Speichel einer infizierten Mücke übertragen. Erzwungene Speichelfluss Assays ermöglichen Bestimmung der potentiellen Vektor auf der Grundlage der einzelnen Mücken, den Verzicht auf Tierversuche. Die Methode ist geeignet, eine große Anzahl von Mücken in einem Experiment innerhalb kurzer Zeit zu analysieren. Erzwungene Speichelfluss Assays wurden verwendet, um 856 einzelne Mücken in Deutschland, darunter zwei verschiedene gefangen analysieren Culex Pipiens Pipiens Biotope, Culex Torrentium sowie Aedes Albopictus, die experimentell infiziert wurden mit Zika-Virus (ZIKV) und inkubierten bei 18 ° C und 27 ° C für zwei bis drei Wochen. Die Ergebnisse zeigten die mangelnde vektorkompetenz von verschiedenen Culex Taxa für ZIKV. Im Gegensatz dazu war Aedes Albopictus anfällig für ZIKV, aber nur bei 27 ° C, mit Übertragungsraten, die ähnlich wie eine Aedes Aegypti Labor Kolonie parallel getestet.

Aedes Aegypti ist als kompetenter Vektor für ZIKV zumindest unter tropischen Klimabedingungen12bekannt. Daher verwendet wir Ae. Aegypti als Positivkontrolle der Assay etablieren und IRs sowie TRs bei einer Inkubationstemperatur von 27 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von 80 % zu analysieren. IR und TR wurden definiert, wie zuvor beschrieben von Fortuna Et Al. 13. Challenged Ae. Aegypti zeigte IR von 50 % und 72 % und TR von 42 % und 31 % bei 14 und 21 Tagen post Infektion (dpi), bzw. (Abbildung 1A und 1 b). Anschließend wurden europäische Stechmücken für ZIKV Infektion und Übertragung mit tropischen sowie gemäßigten klimatischen Bedingungen getestet.
Bei 27 ° C Inkubationstemperatur zeigten alle Mückenarten ZIKV Infektion an 14 dpi sowie 21 dpi, mit Ausnahme von s. Pipiens Cx. und Cx. Torrentium Einzelpersonen, die mit 14 dpi nur positiv waren. Alle Arten der Aedes zeigte höhere IRs (zwischen 50 % und 72 %) sowie höhere virale RNA-Konzentration (106 bis 109 RNA-Kopien/Moskito-Proben) im Vergleich zu den verschiedenen Taxa Culex , offenbart die IRs zwischen 0 % und 32 % und Viruslast von 103 104 RNA-Kopien/Moskito-Proben. Alle Arten der Aedes angezeigt ZIKV-positiven Speichel (TR 13 – 42 %), während keiner der Speichelproben von Culex Taxa ZIKV (Abbildung 1A und 1 b) enthalten. Interessanterweise Übertragungsraten bei 21 dpi waren ähnlich in Ae. Aegypti und Ae. Albopictus aus Deutschland (30 %), aber deutlich niedriger in Ae. Albopictus aus Italien (13 %).
Inkubation von herausgefordert Mücken bei mäßiger Temperatur von 18 ° C zeigte im Allgemeinen niedriger Virus lädt in der Aedes -Arten (104– 106 RNA Kopien/Mücke) sowie in den verschiedenen Culex Taxa (102 –104 RNA Kopien/Mücke). Jedoch wurde bei 18 ° C Inkubationstemperatur, Übertragung von ZIKV nicht für eines der untersuchten Mückenarten beobachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> Abbildung 1: Übertragungsraten von Mücken experimentell infiziert mit ZIKV. Ergebnisse der Vektor-Kompetenz-Studium mit ZIKV in verschiedenen Mückenarten. Sechs verschiedene Moskito Taxa wurden mit ZIKV infiziert und bei 27 ° C und 18 ° C für 14 (A) oder 21 (B) Tage inkubiert. TR ist definiert als die Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper. Die Gesamtzahl der Moskitos untersucht wurde 856, mit einem Minimum von 30 Personen für jede Zeit-Punkt/Temperatur/Moskito-Taxa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Aufrufe.  Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.

Serie: Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

Injektion eines. stephensi Embryonen zu generieren Malaria-resistenter Moskitos

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Forschung

Biologie

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

Verwendung von Drehstabtest als Methode für die qualitative Analyse von Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Pflege, Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infizierte

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protokolle für die Prüfung der Toxizität von neuartigen Insektizide Chemikalien, Mücken

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable production of mosquitoes is currently inhibited by the supply of fresh vertebrate blood. Alternatives to blood are required to promote efficient control strategies for malaria and other vector borne diseases that are transmitted by blood feeding insects. With this in mind, artificial liquid diets were formulated as substitutes for fresh vertebrate blood. Herein we report a blood-free artificial liquid diet that delivers feeding rates similar to blood and mimics the physiological effects of a fresh vertebrate blood meal. The diet induces ovarian and egg maturation of Anopheles mosquitoes and also produces good larval survival and development of functional adults. The formulated blood-free liquid diet is an important advance towards sustainable mosquito breeding in captivity and will reduce the maintenance costs of mosquito colonies and eliminate the need for fresh vertebrate blood.

A protocol is presented for formulation of a blood-free artificial diet to feed Anopheles mosquitoes in captivity. This diet has a similar performance to vertebrate blood and triggers oogenesis and egg maturation and produces viable adult progeny.

Eine blutfreie Diät, um Anopheline-Mücken zu hinterziehen

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Glomeruläres Outgrowth als Ex-Vivo-Assay zur Analyse von Pfaden, die an der Parietalepithel Cell Activation beteiligt sind

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...