Malariaparasiten wie Mücken, die eine wichtige Rolle bei der Ausbreitung der Krankheit spielen. Bisher war es nicht möglich, Malariamücken ohne Blut zu züchten. Und um diese Einschränkung zu überwinden, beschreibt unser Protokoll eine Blutersatzdiät, die in der Lage ist, die Mückenzucht in der Branche zu unterstützen.
Die Verwendung von blutfreier Ernährung ist sehr vorteilhaft gegenüber Blut. Eine blutfreie Ernährung hat nicht die ethischen Zwänge wie die Verwendung von menschlichem Blut, oder Versuchstiere. Das Ersetzen von Tieren im Experiment ist Teil unserer drei R-Politik.
Ersetzen, reduzieren, verfeinern. Die Nichtverwendung von Blut reduziert die Kosten und die Logistik, die mit der Sammlung, Lagerung und Wartung von rotem Blut verbunden ist. Die Verwendung künstlicher Diäten kann das Testen von Antiplasmodiummolekülen erleichtern.
Bisher haben wir unsere Ernährung mit verschiedenen Anopheles-Arten getestet. In allen von ihnen wurde die Ernährung von den Weibchen gut eingehäut und erlaubte die Eiproduktion und das Legen. Wir glauben, dass diese Ernährung eine mögliche Nutzung für die Aufzucht anderer Mückenarten hat.
Tatsächlich testen wir es jetzt auf Aedes, einen Vektor vieler Krankheiten wie Dengue-Fieber, Zika-Virus oder Gelbfieber. Halten Sie Anopheles coluzzii yaonde Stamm Mücken in einem Raum bei 26 Grad Celsius, 75% Luftfeuchtigkeit, und unter einem 12 Stunden bis 12 Stunden hellen dunklen Zyklus. Hausmücken unter Verwendung von Standard-Insektoraten in einem einzigen Käfig, um die Paarung zu gewährleisten.
Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um Mückenpupas in einem kleinen Wasserbehälter zu sammeln. Legen Sie den Behälter in einen Mückenkäfig, damit erwachsene Mücken auftauchen und sich paaren können. 10% Glukose-Fütterungslösung im Käfig.
Drei Tage nach der Entstehung, verwenden Sie einen Aspirator, um die notwendige Anzahl von Weibchen aus dem Lagerkäfig in einem Papierbecher zu sammeln. Zur Unterscheidung: Weibchen sind größer und Männchen haben einen breiteren und gefiederten Proboscis. Entfernen Sie einen Tag vor der Fütterung die 10%Glukose-Fütterungslösung.
Am nächsten Tag, bereiten künstliche flüssige Diäten unter sterilen Bedingungen im laminaren Strömungsschrank nach dem Manuskript. Fügen Sie alle Zutaten in ein Kunststoffrohr. Mischen Sie alle Zutaten gründlich und filtern Sie mit einem 0,45 Mikron Mikrofilter.
Füllen Sie eine sterile 1 Milliliter Spritze mit einer 27 Gauge HalbzollNadel mit 100 Mikroliter n eines Milligramm pro Milliliter Heparin. Dann anästhesieren sechs bis acht Wochen alte CD eine weibliche Mäuse mit Ketamin und Xylazin mit der intraperitonealen Route. Bewerten Sie, ob die Maus eine Muskelreaktion und Reaktion auf verschiedene körperliche Reize anzeigt.
Führen Sie die Herzpunktion durch. Dann sammeln Sie Blut von der Maus in ein Mikrorohr und halten Sie Blut bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Als nächstes sammeln Sie etwa 30 weibliche Mücken aus dem Stockkäfig mit einem Aspirator.
Übertragen Sie die weiblichen Mücken auf 500 Milliliter Papierbecher und decken Sie sie mit einem feinen Moskitonetz, damit sie nicht entkommen können. Dehnen Sie Parafilmmembran über den Mund des Glaszubringers, um die Mahlzeit zu enthalten. Tragen Sie eine Glasglocke künstliche Fütterungsgerät mit Kunststoffrohren an der Oberseite jeder Tasse verbunden.
Stellen Sie einen konstanten Wasserfluss zum zylindrischen Schlauch und Feeder bereit, so dass die Temperatur im Inneren bei ca. 37,5 Grad Celsius gehalten wird. Tragen Sie einen Milliliter vorgewärmte flüssige Diät bei 37 Grad Celsius oder frisches Mausblut in einen Glaszubringer auf. Füttern Sie die Mücken für 60 Minuten im Dunkeln bei 26 Grad Celsius.
Nach künstlicher Fütterung die Mücken 30 Sekunden lang bei 20 Grad Celsius kalt anästhesieren. Dann legen Sie die Mücken in eine gekühlte Petrischale. Erfassen Sie die Anzahl der vollständig engorged weiblichen Mücken.
Trennen Sie 30 voll engorged Weibchen und setzen Sie sie auf einen neuen Käfig. Legen Sie nun ein befeuchtetes Filterpapier an die Unterseite jedes Käfigs. Halten Sie die Mücken bei 26 Grad Celsius, 75% Luftfeuchtigkeit und unter einem 12-Stunden-bis 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus mit 10% Glucose ad libitum.
Nach 96 Stunden und 120 Stunden nach der Fütterung die Eier mit Hilfe einer Handlupe zählen. Das Filterpapier mit destilliertem Wasser überfluten, um die Eier in mit destilliertem Wasser gefüllte Schalen zu sammeln. Füttern Sie die Larven täglich mit ca. 13 Milligramm gemahlenem Fischfutter pro Tablett.
Entfernen Sie tote Pupae und Larven mit einer Plastikpipette täglich. Wenn sich alle Welpen zu Erwachsenen entwickelt haben, zählen Sie die Anzahl der erwachsenen Männer und Frauen, registrieren Sie die Daten von Schraffur und Tod und berechnen Sie die Sterblichkeitsraten. Um die Langlebigkeit zu testen, sammeln Sie 15 erwachsene Männchen und 15 erwachsene Weibchen aus der F1-Generation jeder Diätgruppe in eine Papiertasse.
Füttern Sie Erwachsene mit 10%Glukoselösung ad libitum. Verwenden Sie eine Pinzette oder einen Pinsel, um die toten Erwachsenen täglich zu entfernen. Halten Sie die Mücken bei der gleichen Temperatur, Feuchtigkeit, LichtzyklusBedingungen und Zuckerfütterung Regime.
Registrieren Sie die Todesdaten und berechnen Sie die Langlebigkeit. Um die Flügellänge zu messen, beanten kalte Anästhesisieren Sie fünf Tage alte männliche und weibliche erwachsene Mücken aus jeder Diätgruppe bei 20 Grad Celsius für 90 Sekunden. Unter einem Stereoskop, greifen Sie vorsichtig den Thorax jeder Mücke mit Zange, und legen Sie sie ventrale Seite nach oben.
Sammeln Sie beide Flügel mit einem Skalpell, und legen Sie sie auf einem sauberen Mikroskopschlitten, der einen getrockneten Tropfen Montagemedium für die weitere Messung mit einem abgestuften Okular enthält. Messen Sie die Flügellänge mit einem Stereoskop mit einem Mikrometer. In dieser Studie wurde die Leistung weiblicher Anopheles-Mücken verglichen, die sich mit der formulierten reichen künstlichen Mahlzeit ernährten, und Mücken, die mit der anfänglichen flüssigen Ernährung gefüttert wurden, oder eine frische Blutmahlzeit.
Die Zahl der mit reichhaltigen künstlichen Mahlzeiten gefütterten weiblichen Mücken war mit 89 % mit 89 % signifikant höher als die Zahl der mit Blut ernährten Frauen mit 56 %Die F1-Generation von Mücken, die entweder mit dem Blut oder der reichen künstlichen Mahlzeit gefüttert wurden, hatte vergleichbare Sterblichkeits- und Überlebensraten. Die Variabilität war in den blutgefütterten Mücken höher als bei Mücken, die mit der reichen künstlichen Mahlzeit gefüttert wurden. In Bezug auf die Körpergröße des Erwachsenen lagen die mit reichhaltigen künstlichen Mahlzeiten gefütterten F1-Anopheles-Mücken im erwarteten Bereich und ähnelten dem Blut, das in sektoralen Mücken gefüttert wurde.
Meiner Meinung nach ist es sehr wichtig, die Feeder richtig mit dem Parafilm zu montieren, um einen Bruch zu vermeiden. Wenn die Membran nicht gut an der Glaszuführung befestigt ist, können Sie die Mahlzeit verlieren und wahrscheinlich einige der Mücken verlieren, da sie von der Mahlzeit abgedeckt werden können und sterben können. Wir möchten einen Dual-Choice-Attraktionstest durchführen, zum Beispiel mit einem Olfactometer, damit wir tatsächlich bewerten können, ob unsere Weibchen mehr von der künstlichen Ernährung oder dem Blut angezogen werden.
Außerdem lyophilisieren wir jetzt die künstliche Ernährung und studieren ihre Stabilität unter verschiedenen Temperaturen eine lange Zeit. Neben den offensichtlichen Verbesserungen der Stabilität und Lagerung, an denen wir gearbeitet haben, sollte die langfristige Anwendung der Ernährung auf Mückenfitness und Physiologie untersucht werden. Ich glaube, dass die Herstellung der Anopheles ohne Blut die Erforschung von Vektoren und die Implementierung von Kontrollwerkzeugen, die von einer großen Anzahl von Mücken abhängen, immens erleichtern wird.
