Wir erkennen die Mitglieder des Mably Labor und Narie Storer für ihre technische Unterstützung, und die American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 0635363N) und dem National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) für die Finanzierung.

Teil 1: Egg Produktion und Sammlung <ol><li> Die Nacht vor der Injektion, richten Sie den Fisch in Zuchtbecken mit Trennwänden in Platz. Zur Erhöhung der Gesamtzahl der Eierproduktion, können die Fische in einem Verhältnis von zwei Frauen eingestellt werden, um ein Männchen, falls gewünscht. </li><li> Am nächsten Morgen, nach der Raumbeleuchtung eingeschaltet, ziehen Sie den Teilern von mehreren Tanks und damit für etwa 20 Minuten ungestört Paarungszeit. </li><li> Mit einem Sieb, sammeln die Eier aus der Zucht Käfige und spülen Sie sie mit Ei Wasser. Gießen Sie die Eier in einer Petrischale mit Ei Wasser und entfernen unbefruchteten Eiern und Schmutz mit einem Transfer-Pipette. Fische können in größeren Tanks zusammengefasst werden, um zusätzliche Runden von Eiern für die Injektion zu produzieren. Passen Sie den Zeitpunkt der Entnahme der Eizellen, um eine maximale Anzahl von Eiern, ohne dass sie passieren die einzelnen Zell-Stadium hergestellt werden können. </li><li> Legen Sie einen Objektträger in der umgekehrten Deckel eines 100mm Petrischale. Verwenden Sie einen Transferpipette antreten die Eier gegen die Seite des Schiebers bilden eine einzelne Spalte. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Ei gleiten durch Drücken einer Kimwipe gegen die gegenüberliegende Seite der Eier. (Abbildung 1A) </li></ol> Teil 2: Nadel ziehen, Lade-und Vorbereitung <ol><li> Mit einer Mikropipette Abzieher, ziehen Sie einen 1,0 mm OD Glaskapillare in zwei Nadeln und an einem 150mm Petrischale indem über Silly Putty Rampen. Needles kann im Voraus gezogen werden. </li><li> Backload die Nadel mit 3 ul von Injektionsmaterial mit einem Microloader Pipette. Schütteln Sie die Bolus in Richtung der Nadelspitze bis es wenige oder gar keine Blasen mehr vorhanden sind. </li><li> Schalten Sie die Luftquelle und Mikroinjektor. Legen Sie die Nadel in die Mikroinjektor und versichern eine gute Abdichtung innerhalb des Gehäuses. Prüfen Sie, ob der Mikromanipulator in eine geeignete Position, um für eine breite Palette von Bewegung und Anpassung zu ermöglichen. Bringen Sie die Nadelspitze in die Ebene der Sicht des Mikroskops, hoch über der Bühne, und konzentrieren sich auf die dünnste Bereich der Spitze. Verwenden Sie ein Paar scharfe Zange kneifen Sie die Nadel an einem Punkt, der die Nadel schmal genug zu durchdringen das Chorion und Dotter, aber immer noch der Lage, eine konsistente Perlgröße Blätter. Ein Tropfen Mineralöl auf einem Mikrometer können verwendet werden, um die Lautstärke der einzelnen Injektion zu berechnen. Wenn in das Öl eingespritzt wird, enthält eine Perle mit einem Durchmesser von 0,1 mm 500 pL von Injektionsmaterial (Abbildung 1B); Injektionsvolumina von 500 pL oder 1nL werden üblicherweise verwendet. Drücken Sie das Fußpedal und überwachen die Größe der Raupe beim Trimmen der Nadel und die Anpassung der Einspritzdruck je nach Bedarf. Ideal Injektionsvolumina füllt ca. 10% des Eies Volumen. Die Qualität der Nadelspitze ist von entscheidender Bedeutung, um sowohl die einfache Injektion und die Qualität und Konsistenz der Ergebnisse. </li></ol> Teil 3: Injection <ol><li> Sicherstellen, dass die Embryonen nicht über die Vier-Zellen-Stadium entwickelt. Idealerweise sollte Embryonen im Ein-Zell-Stadium werden. </li><li> Senken Sie die Nadel auf die Spalte von Eiern, hält das Gericht an Stelle mit der anderen Hand. </li><li> Pierce die Oberfläche des Chorion und geben Sie das Eigelb in einem gleichmäßigen Lauf, während Sie für jede Brechen oder Reißen der Dottersacks. Spritzen Sie das Injektionsmaterial in den Dotter (Abbildung 1C). Vermeiden Sie die Injektion von Luftblasen oder Strecken der Dotter entweder kann tödlich sein, um den Embryo. Arbeiten auf der ganzen Linie, stellen Sie den Druck wie nötig, um eine konsistente Perle Größe und mit einer Pipettenspitze zu erhalten, entfernen Sie die Eier unbefruchtet schauen oder während der Injektion zerstört. </li><li> Nach Abschluss einer Säule von Eiern, mit einem sanften Strom von Ei-Wasser in den injizierten Eier in eine saubere Petrischale bewegen. Bei Bedarf wiederholen. Halten Sie mehrere injizierten Embryonen als Kontrolle. Am Ende des ersten Tages, entfernen abgestorbene Embryonen und notieren Sie die Anzahl der injizierten Embryonen. Ersetzen Sie das Ei Wasser in die Schüssel in regelmäßigen Abständen, um die Chance einer Infektion zu verringern. </li></ol> Teil 4: Repräsentative Ergebnisse Je nachdem, was wird gespritzt haben, kann Embryonen mit einer niedrigeren Rate als ihre injizierten Geschwister überleben. Glücklicherweise ist es einfach, eine große Anzahl von ihnen injizieren, so ist dies selten ein Problem. Es ist normal, morphants leicht verzögerte Entwicklung aufweisen können. Zur Veranschaulichung der Ergebnisse der Mikroinjektion, haben wir dieses Protokoll auf ein Niveau des Proteins Heart of Glass (HEG) zu manipulieren. Heg ist ein Transmembranprotein für normale Entwicklung des Herzens notwendig. In seiner Abwesenheit zu entwickeln Embryonen Herzen mit riesigen Zustrom Traktate und Kammern 1. Wir injizierten zwei bisher unbeschriebene Morpholinos gegen heg, heg_e3i3_egfr1 und heg_e4i4_egfr2, bei einer Konzentration von 500 uM. Bei 2 Tage nach der Befruchtung, werden die injizierten Geschwister steuert normal, wie erwartet (Abb. 2A und B). Embryonen mit heg_e3i3_egfr1 gespritzt haben Hirnödem (Abbildung 2C). Obwohl die Herzen der meisten dieser morphants Morphologie verändert haben, sind ihre Kammern normal dimensionierte (Abbildung 2D). Embryonen injiziertmit heg_e4i4_egfr2 weisen variable Herzfehler. Manche erscheinen normal, während andere große Zustrom Traktate und mäßig vergrößert Vorhöfen (Abb. 2E und F) haben. Die HEG-Mutante, wie zuvor 1 berichtet, hat eine enorm vergrößerte Einflusstrakt und Atrium (Abb. 2G-und H). Wir haben auch Wildtyp-Embryonen mit 400 ng / ul mRNA aus voller Länge heg cDNA umgeschrieben injiziert. Während injizierten Kontrollen normal entwickeln (Abb. 3A und B), Embryonen mit heg mRNA weisen ein Spektrum von Phänotypen von Wildtyp-Auftritt zu schweren Zyklopie injiziert, Verkürzung der Hauptteil Achse, Nekrose des Kopfes und des Körpers, und Spaltbildungen (Abbildung 3C und D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Abbildung 1. Embryonen injiziert werden gegen einen Objektträger in eine Petrischale (A) gefüttert. Injektionsvolumen wird durch Injektion in Mineralöl auf einem Mikrometer platziert bestimmt. Ein Injektionsvolumen von 500 pL, die üblicherweise verwendet wird, hat einen Durchmesser von 0,1 mm (B). Unmittelbar nach der Injektion wird der Morpholino-oder mRNA sichtbar als punctuate Ort in den Dotter (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Abbildung 2. Nach 2 Tagen nach der Befruchtung haben injizierten Embryonen keine grobe Mängel (A) oder Herz-Phänotyp (B). Embryonen mit dem Morpholino heg_e3i3_egfr1 gespritzt haben Hirnödem (C, Pfeil), aber in der Regel großen Herzkammern (D). Einige Embryonen mit dem Morpholino heg_e4i4_egfr2 gespritzt haben vergrößerten Zufluss Traktate und Vorhöfe (E, F). HEG-Mutanten eine stark vergrößerte Zufluss Traktate und Vorhöfe (G, H). (A), (C), (E) und (G) sind 4x DIC Bilder; (B), (D), (F) und (H) sind 20x DIC Bilder. a = Atrium, it = Einflusstrakt. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Abbildung 3. Nach 24 Stunden nach der Befruchtung, nicht injizierten Embryonen haben einen langen, geraden Körper ohne Nekrose oder Spaltbildungen (A) und zwei klar definierte Augen mit einem Neuralrohr zwischen ihnen (B). Einige Embryonen mit heg mRNA injiziert, zeigen dagegen eine verkürzte Körperachse, Nekrose, deformierte Somiten (C), und Zyklopie (D). (A) und (C) sind 4x DIC Bilder; (B) und (D) sind 20x DIC Bilder.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

Eine der Stärken des Zebrafisch-Modell ist die Leichtigkeit, mit der bestimmte Genprodukte hinzugefügt werden können oder eliminiert aus dem Embryo durch Mikroinjektion. Um ubiquitär überexprimieren ein bestimmtes Protein, das mRNA ist es in den Dotter an der 1-Zell-Stadium injiziert. Während des Embryos weitere Entwicklung wird die RNA in der gesamten Organismus verteilt und übersetzt. Umgekehrt an ein bestimmtes Protein zu beseitigen, sind Morpholinos verwendet. Morpholinos werden synthetische Oligonukleotide mit Antisense-Komplementarität auf bestimmte RNAs konzipiert. Wie mRNAs sind Morpholinos in den Dotter an der 1-Zell-Stadium injiziert. Im Inneren des Embryos binden sie ihre Ziel-RNAs, die Verhütung Übersetzung. Die wichtigste Änderung, die für jede Morpholino-oder mRNA vorgenommen werden muss, ist die Konzentration des injizierten Materials. Eine zu hohe Konzentration von entweder Morpholino-oder mRNA kann unspezifische Toxizität, während jeder Morpholino muss empirisch überprüft werden, um seine optimale Konzentration, in der Regel Morpholino-Konzentrationen zwischen 200 um und 500 um festzustellen, knock down Genaktivität effektiv, ohne dass nicht-spezifische Defekte. Die genaue Größe der Nadel Öffnung ist nicht entscheidend. Innerhalb eines Bereichs von Nadelgrößen, Einspritzdruck und Einspritzzeitpunkt können angepasst werden, um ein Bolus von der richtigen Lautstärke zu produzieren. Morpholinos haben viele Anwendungen, einschließlich der funktionalen Zerlegung der Domänen innerhalb eines Proteins. Wenn entwickelt, um spezifische Exon-Intron-Übergänge Ziel wird Morpholinos Spleißen von dort vorkommenden verhindern. Wir untersuchten die Auswirkungen von zwei Morpholinos binden Exon-Intron-Übergänge in der prä-mRNA von heg. Der Morpholino heg_e3i3_egfr1 bindet die Verbindung zwischen Exon 3 und Intron 3, verhindert das Spleißen Maschinen aus Einbeziehung Exon 3 zu reifen Transkripte. Der Morpholino heg_e4i4_egfr2 ähnlich entfernt Exon 4. Beide Exons 3 und 4 kodieren Domains mit EGF-ähnliche Wiederholungen. Einige Embryonen mit heg_e4i4_egfr2 mäßig Phänokopie der Mutante injiziert; weitere Experimente erforderlich, um die Rolle der Heg Exon 4 in die Entwicklung des Herzens zu verstehen. Überraschenderweise wurden Embryonen mit heg_e3i3_egfr1 injiziert Hirnödem, ein Feature nicht in heg Mutanten zu sehen. Dies kann darauf zurückzuführen sein, die Fähigkeit der Morpholinos von Müttern Transkripte, die nicht betroffen sein würde in zygotischen Mutanten binden.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

Einer der Vorteile eines Studiums Zebrafisch ist die Leichtigkeit und Schnelligkeit der Bearbeitung Protein-Spiegel in den Embryo. Morpholinos, die synthetische Oligonukleotide mit Antisense Komplementarität zur Ziel-RNAs sind, kann der Embryo hinzugefügt werden, um die Expression eines bestimmten Gens Produkt zu reduzieren. Umgekehrt können verarbeitet mRNA um den Embryo hinzugefügt werden, um Werte eines Gens zu erhöhen. Das Fahrzeug zum Hinzufügen entweder mRNA oder Morpholino, um einen Embryo ist die Mikroinjektion. Mikroinjektion ist eine effiziente und schnelle, sodass für die Injektion von Hunderten von Embryonen pro Stunde. Dieses Video zeigt alle Schritte in Mikroinjektion beteiligt. Kurz gesagt, werden Eier sofort nach der Verlegung gesammelt und gegen einen Objektträger in eine Petrischale ausgekleidet. Als nächstes wird ein spitzen Nadel mit Injektionsmaterial bestückt mit einem Mikroinjektor und eine Luftquelle verbunden, und die Mikroinjektor Bedienelemente sind angepasst, um eine wünschenswerte Injektionsvolumen zu produzieren. Schließlich wird die Nadel in die Embryos Eigelb getaucht und die Morpholino-oder mRNA ist ausgeschlossen.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Dieses Video zeigt, wie Morpholino-oder mRNA in Zebrafisch-Embryonen können bei der Ein-Zell-Stadium zu verringern oder zu erhöhen das Niveau der spezifischen Genprodukte bei der späteren Entwicklung injiziert werden.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

77.1K Aufrufe.  Harvard Medical School. Dieses Video zeigt, wie Morpholino-oder mRNA in Zebrafisch-Embryonen können bei der Ein-Zell-Stadium zu verringern oder zu erhöhen das Niveau der spezifischen Genprodukte bei der späteren Entwicklung injiziert werden.

Serie: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Forschung

Biologie

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

Gene Trapping Mit Gal4 in Zebrafisch

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...