Wir erkennen die Mitglieder des Mably Labor und Narie Storer für ihre technische Unterstützung, und die American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 0635363N) und dem National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) für die Finanzierung.

Teil 1: Egg Produktion und Sammlung <ol><li> Die Nacht vor der Injektion, richten Sie den Fisch in Zuchtbecken mit Trennwänden in Platz. Zur Erhöhung der Gesamtzahl der Eierproduktion, können die Fische in einem Verhältnis von zwei Frauen eingestellt werden, um ein Männchen, falls gewünscht. </li><li> Am nächsten Morgen, nach der Raumbeleuchtung eingeschaltet, ziehen Sie den Teilern von mehreren Tanks und damit für etwa 20 Minuten ungestört Paarungszeit. </li><li> Mit einem Sieb, sammeln die Eier aus der Zucht Käfige und spülen Sie sie mit Ei Wasser. Gießen Sie die Eier in einer Petrischale mit Ei Wasser und entfernen unbefruchteten Eiern und Schmutz mit einem Transfer-Pipette. Fische können in größeren Tanks zusammengefasst werden, um zusätzliche Runden von Eiern für die Injektion zu produzieren. Passen Sie den Zeitpunkt der Entnahme der Eizellen, um eine maximale Anzahl von Eiern, ohne dass sie passieren die einzelnen Zell-Stadium hergestellt werden können. </li><li> Legen Sie einen Objektträger in der umgekehrten Deckel eines 100mm Petrischale. Verwenden Sie einen Transferpipette antreten die Eier gegen die Seite des Schiebers bilden eine einzelne Spalte. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Ei gleiten durch Drücken einer Kimwipe gegen die gegenüberliegende Seite der Eier. (Abbildung 1A) </li></ol> Teil 2: Nadel ziehen, Lade-und Vorbereitung <ol><li> Mit einer Mikropipette Abzieher, ziehen Sie einen 1,0 mm OD Glaskapillare in zwei Nadeln und an einem 150mm Petrischale indem über Silly Putty Rampen. Needles kann im Voraus gezogen werden. </li><li> Backload die Nadel mit 3 ul von Injektionsmaterial mit einem Microloader Pipette. Schütteln Sie die Bolus in Richtung der Nadelspitze bis es wenige oder gar keine Blasen mehr vorhanden sind. </li><li> Schalten Sie die Luftquelle und Mikroinjektor. Legen Sie die Nadel in die Mikroinjektor und versichern eine gute Abdichtung innerhalb des Gehäuses. Prüfen Sie, ob der Mikromanipulator in eine geeignete Position, um für eine breite Palette von Bewegung und Anpassung zu ermöglichen. Bringen Sie die Nadelspitze in die Ebene der Sicht des Mikroskops, hoch über der Bühne, und konzentrieren sich auf die dünnste Bereich der Spitze. Verwenden Sie ein Paar scharfe Zange kneifen Sie die Nadel an einem Punkt, der die Nadel schmal genug zu durchdringen das Chorion und Dotter, aber immer noch der Lage, eine konsistente Perlgröße Blätter. Ein Tropfen Mineralöl auf einem Mikrometer können verwendet werden, um die Lautstärke der einzelnen Injektion zu berechnen. Wenn in das Öl eingespritzt wird, enthält eine Perle mit einem Durchmesser von 0,1 mm 500 pL von Injektionsmaterial (Abbildung 1B); Injektionsvolumina von 500 pL oder 1nL werden üblicherweise verwendet. Drücken Sie das Fußpedal und überwachen die Größe der Raupe beim Trimmen der Nadel und die Anpassung der Einspritzdruck je nach Bedarf. Ideal Injektionsvolumina füllt ca. 10% des Eies Volumen. Die Qualität der Nadelspitze ist von entscheidender Bedeutung, um sowohl die einfache Injektion und die Qualität und Konsistenz der Ergebnisse. </li></ol> Teil 3: Injection <ol><li> Sicherstellen, dass die Embryonen nicht über die Vier-Zellen-Stadium entwickelt. Idealerweise sollte Embryonen im Ein-Zell-Stadium werden. </li><li> Senken Sie die Nadel auf die Spalte von Eiern, hält das Gericht an Stelle mit der anderen Hand. </li><li> Pierce die Oberfläche des Chorion und geben Sie das Eigelb in einem gleichmäßigen Lauf, während Sie für jede Brechen oder Reißen der Dottersacks. Spritzen Sie das Injektionsmaterial in den Dotter (Abbildung 1C). Vermeiden Sie die Injektion von Luftblasen oder Strecken der Dotter entweder kann tödlich sein, um den Embryo. Arbeiten auf der ganzen Linie, stellen Sie den Druck wie nötig, um eine konsistente Perle Größe und mit einer Pipettenspitze zu erhalten, entfernen Sie die Eier unbefruchtet schauen oder während der Injektion zerstört. </li><li> Nach Abschluss einer Säule von Eiern, mit einem sanften Strom von Ei-Wasser in den injizierten Eier in eine saubere Petrischale bewegen. Bei Bedarf wiederholen. Halten Sie mehrere injizierten Embryonen als Kontrolle. Am Ende des ersten Tages, entfernen abgestorbene Embryonen und notieren Sie die Anzahl der injizierten Embryonen. Ersetzen Sie das Ei Wasser in die Schüssel in regelmäßigen Abständen, um die Chance einer Infektion zu verringern. </li></ol> Teil 4: Repräsentative Ergebnisse Je nachdem, was wird gespritzt haben, kann Embryonen mit einer niedrigeren Rate als ihre injizierten Geschwister überleben. Glücklicherweise ist es einfach, eine große Anzahl von ihnen injizieren, so ist dies selten ein Problem. Es ist normal, morphants leicht verzögerte Entwicklung aufweisen können. Zur Veranschaulichung der Ergebnisse der Mikroinjektion, haben wir dieses Protokoll auf ein Niveau des Proteins Heart of Glass (HEG) zu manipulieren. Heg ist ein Transmembranprotein für normale Entwicklung des Herzens notwendig. In seiner Abwesenheit zu entwickeln Embryonen Herzen mit riesigen Zustrom Traktate und Kammern 1. Wir injizierten zwei bisher unbeschriebene Morpholinos gegen heg, heg_e3i3_egfr1 und heg_e4i4_egfr2, bei einer Konzentration von 500 uM. Bei 2 Tage nach der Befruchtung, werden die injizierten Geschwister steuert normal, wie erwartet (Abb. 2A und B). Embryonen mit heg_e3i3_egfr1 gespritzt haben Hirnödem (Abbildung 2C). Obwohl die Herzen der meisten dieser morphants Morphologie verändert haben, sind ihre Kammern normal dimensionierte (Abbildung 2D). Embryonen injiziertmit heg_e4i4_egfr2 weisen variable Herzfehler. Manche erscheinen normal, während andere große Zustrom Traktate und mäßig vergrößert Vorhöfen (Abb. 2E und F) haben. Die HEG-Mutante, wie zuvor 1 berichtet, hat eine enorm vergrößerte Einflusstrakt und Atrium (Abb. 2G-und H). Wir haben auch Wildtyp-Embryonen mit 400 ng / ul mRNA aus voller Länge heg cDNA umgeschrieben injiziert. Während injizierten Kontrollen normal entwickeln (Abb. 3A und B), Embryonen mit heg mRNA weisen ein Spektrum von Phänotypen von Wildtyp-Auftritt zu schweren Zyklopie injiziert, Verkürzung der Hauptteil Achse, Nekrose des Kopfes und des Körpers, und Spaltbildungen (Abbildung 3C und D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Abbildung 1. Embryonen injiziert werden gegen einen Objektträger in eine Petrischale (A) gefüttert. Injektionsvolumen wird durch Injektion in Mineralöl auf einem Mikrometer platziert bestimmt. Ein Injektionsvolumen von 500 pL, die üblicherweise verwendet wird, hat einen Durchmesser von 0,1 mm (B). Unmittelbar nach der Injektion wird der Morpholino-oder mRNA sichtbar als punctuate Ort in den Dotter (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Abbildung 2. Nach 2 Tagen nach der Befruchtung haben injizierten Embryonen keine grobe Mängel (A) oder Herz-Phänotyp (B). Embryonen mit dem Morpholino heg_e3i3_egfr1 gespritzt haben Hirnödem (C, Pfeil), aber in der Regel großen Herzkammern (D). Einige Embryonen mit dem Morpholino heg_e4i4_egfr2 gespritzt haben vergrößerten Zufluss Traktate und Vorhöfe (E, F). HEG-Mutanten eine stark vergrößerte Zufluss Traktate und Vorhöfe (G, H). (A), (C), (E) und (G) sind 4x DIC Bilder; (B), (D), (F) und (H) sind 20x DIC Bilder. a = Atrium, it = Einflusstrakt. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Abbildung 3. Nach 24 Stunden nach der Befruchtung, nicht injizierten Embryonen haben einen langen, geraden Körper ohne Nekrose oder Spaltbildungen (A) und zwei klar definierte Augen mit einem Neuralrohr zwischen ihnen (B). Einige Embryonen mit heg mRNA injiziert, zeigen dagegen eine verkürzte Körperachse, Nekrose, deformierte Somiten (C), und Zyklopie (D). (A) und (C) sind 4x DIC Bilder; (B) und (D) sind 20x DIC Bilder.

<ol><li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li>
</ol>

Eine der Stärken des Zebrafisch-Modell ist die Leichtigkeit, mit der bestimmte Genprodukte hinzugefügt werden können oder eliminiert aus dem Embryo durch Mikroinjektion. Um ubiquitär überexprimieren ein bestimmtes Protein, das mRNA ist es in den Dotter an der 1-Zell-Stadium injiziert. Während des Embryos weitere Entwicklung wird die RNA in der gesamten Organismus verteilt und übersetzt. Umgekehrt an ein bestimmtes Protein zu beseitigen, sind Morpholinos verwendet. Morpholinos werden synthetische Oligonukleotide mit Antisense-Komplementarität auf bestimmte RNAs konzipiert. Wie mRNAs sind Morpholinos in den Dotter an der 1-Zell-Stadium injiziert. Im Inneren des Embryos binden sie ihre Ziel-RNAs, die Verhütung Übersetzung. Die wichtigste Änderung, die für jede Morpholino-oder mRNA vorgenommen werden muss, ist die Konzentration des injizierten Materials. Eine zu hohe Konzentration von entweder Morpholino-oder mRNA kann unspezifische Toxizität, während jeder Morpholino muss empirisch überprüft werden, um seine optimale Konzentration, in der Regel Morpholino-Konzentrationen zwischen 200 um und 500 um festzustellen, knock down Genaktivität effektiv, ohne dass nicht-spezifische Defekte. Die genaue Größe der Nadel Öffnung ist nicht entscheidend. Innerhalb eines Bereichs von Nadelgrößen, Einspritzdruck und Einspritzzeitpunkt können angepasst werden, um ein Bolus von der richtigen Lautstärke zu produzieren. Morpholinos haben viele Anwendungen, einschließlich der funktionalen Zerlegung der Domänen innerhalb eines Proteins. Wenn entwickelt, um spezifische Exon-Intron-Übergänge Ziel wird Morpholinos Spleißen von dort vorkommenden verhindern. Wir untersuchten die Auswirkungen von zwei Morpholinos binden Exon-Intron-Übergänge in der prä-mRNA von heg. Der Morpholino heg_e3i3_egfr1 bindet die Verbindung zwischen Exon 3 und Intron 3, verhindert das Spleißen Maschinen aus Einbeziehung Exon 3 zu reifen Transkripte. Der Morpholino heg_e4i4_egfr2 ähnlich entfernt Exon 4. Beide Exons 3 und 4 kodieren Domains mit EGF-ähnliche Wiederholungen. Einige Embryonen mit heg_e4i4_egfr2 mäßig Phänokopie der Mutante injiziert; weitere Experimente erforderlich, um die Rolle der Heg Exon 4 in die Entwicklung des Herzens zu verstehen. Überraschenderweise wurden Embryonen mit heg_e3i3_egfr1 injiziert Hirnödem, ein Feature nicht in heg Mutanten zu sehen. Dies kann darauf zurückzuführen sein, die Fähigkeit der Morpholinos von Müttern Transkripte, die nicht betroffen sein würde in zygotischen Mutanten binden.

<table><tbody><tr><td>Microinjector</td><td>Tool</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Tool</td><td>Narishige International</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Tool</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Pipettes</td><td>Tool</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

Einer der Vorteile eines Studiums Zebrafisch ist die Leichtigkeit und Schnelligkeit der Bearbeitung Protein-Spiegel in den Embryo. Morpholinos, die synthetische Oligonukleotide mit Antisense Komplementarität zur Ziel-RNAs sind, kann der Embryo hinzugefügt werden, um die Expression eines bestimmten Gens Produkt zu reduzieren. Umgekehrt können verarbeitet mRNA um den Embryo hinzugefügt werden, um Werte eines Gens zu erhöhen. Das Fahrzeug zum Hinzufügen entweder mRNA oder Morpholino, um einen Embryo ist die Mikroinjektion. Mikroinjektion ist eine effiziente und schnelle, sodass für die Injektion von Hunderten von Embryonen pro Stunde. Dieses Video zeigt alle Schritte in Mikroinjektion beteiligt. Kurz gesagt, werden Eier sofort nach der Verlegung gesammelt und gegen einen Objektträger in eine Petrischale ausgekleidet. Als nächstes wird ein spitzen Nadel mit Injektionsmaterial bestückt mit einem Mikroinjektor und eine Luftquelle verbunden, und die Mikroinjektor Bedienelemente sind angepasst, um eine wünschenswerte Injektionsvolumen zu produzieren. Schließlich wird die Nadel in die Embryos Eigelb getaucht und die Morpholino-oder mRNA ist ausgeschlossen.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Dieses Video zeigt, wie Morpholino-oder mRNA in Zebrafisch-Embryonen können bei der Ein-Zell-Stadium zu verringern oder zu erhöhen das Niveau der spezifischen Genprodukte bei der späteren Entwicklung injiziert werden.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

microinjection-of-zebrafish-embryos-to-analyze-gene-function

Research

JoVE Journal

Biology

77.4K Aufrufe.  Harvard Medical School. Dieses Video zeigt, wie Morpholino-oder mRNA in Zebrafisch-Embryonen können bei der Ein-Zell-Stadium zu verringern oder zu erhöhen das Niveau der spezifischen Genprodukte bei der späteren Entwicklung injiziert werden.

Serie: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Forschung

Neurowissenschaften

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Entwicklungsbiologie

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression. Morpholinos (MOs) have the advantage in biological stability over DNA oligos because they are not susceptible to enzymatic degradation. For optimal effectiveness, MOs are injected into 1-4 cell stage embryos. The temporal efficacy of knockdown is variable, but MOs are believed to lose their effects due to dilution eventually. Morpholino dilution and injection amount should be closely controlled to minimize the occurrence of off-target effects while maintaining on-target efficacy. Additional complementary tools, such as CRISPR/Cas9 should be performed against the target gene of interest to generate mutant lines and to confirm the morphant phenotype with these lines. This article will demonstrate how to design, prepare, and microinject a translation-blocking morpholino against hand2 into the yolk of 1-4 cell stage zebrafish embryos to knockdown hand2 function and rescue these "morphants" by co-injection of mRNA encoding the corresponding cDNA. Subsequently, the efficacy of the morpholino microinjections is assessed by first verifying the presence of morpholino in the yolk (co-injected with phenol red) and then by phenotypic analysis. Moreover, cardiac functional analysis to test for knockdown efficacy will be discussed. Finally, assessing the effect of morpholino-induced blockage of gene translation via western blotting will be explained.

<meta charset="utf8"></head><body>Design und Mikroinjektion von Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden und mRNA in Zebrafischembryonen zur Aufklärung spezifischer Genfunktionen in der Herzentwicklun

The present protocol describes designing, preparing, and microinjecting a translational-blocking morpholino against a representative cardiac gene; Heart And Neural Crest Derivatives Expressed2 (hand2) into the yolk of newly fertilized zebrafish embryos to knock down gene function. It also shows a transient rescue of these "morphants" by co-injection of mRNA encoding this gene product.

Design und Mikroinjektion von Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden und mRNA in Zebrafischembryonen zur Aufklärung spezifischer Genfunktionen in der Herzentwicklung

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression.  ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

Biochemie

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

Zusammenfassung

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Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Design und Mikroinjektion von Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden und mRNA in Zebrafischembryonen zur Aufklärung spezifischer Genfunktionen in der Herzentwicklung

Design und Mikroinjektion von Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden und mRNA in Zebrafischembryonen zur Aufklärung spezifischer Genfunktionen in der Herzentwicklung

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz

Hohe Auflösung Ganze Berge