Die Autoren möchten Thankthe Jenkins-Mikroskopie-Anlage an der University of Wyoming für ihre Hilfe und die Mitglieder des Bushman Lab, Kelly Roballo, Hayden wahr, Wupu Osimanjiang und Subash Dhunghana, um Unterstützung bei der Pflege der Tiere. Diese Publikation wurde durch eine institutionelle Development Award (IDeA) aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant # 2P20GM103432 ermöglicht.

Erwachsene Sprague-Dawley Ratten wurden in diesem Projekt verwendet und alle Verfahren wurden von der University of Wyoming institutionelle Tierpflege und Use Committee genehmigt.
1. Chirurgie und In Vivo -Nerv-Fixierung
Hinweis: Herstellerinformationen für alle Materialien und Geräte verwendet, die in diesem Protokoll finden Sie in der Tabelle der Materialien.
Hinweis: In Vivo Nerv Fixierung wird verwendet, um das Gewebe zu bewahren und reduzieren strukturelle Verschlechterung, die zwischen dem Zeitpunkt des Todes und Sammlung der Nerven auftreten können. In Vivo Gewebe Fixierung ist ein Standardverfahren für die Vorbereitung des Nervensystems Gewebe für Histologie, wo die Perfusion ist oft eine Vorstufe dazu. Die Anordnung und Größe der peripheren Nerven, die für in-situ Fixierung erlaubt. Wir empfehlen nicht Sammlung und Fixierung des Gewebes nach Euthanasie durch die Möglichkeit der Schädigung von Gewebe.
<ol><li>Die Ratte für die Vollnarkose vorbereiten, indem man sie in eine Kammer Induktion mit 2-3 % Isofluran, dann die narkotisierten Ratte in Bauchlage auf der Oberseite eine Dissektion Matte und auch bleiben bei 1-2 % der Isofluran über Narkose bugnase. Um ausreichende Tiefe der Narkose zu gewährleisten, testen Sie Tiere für Pedal Rückzug auf die Hinterfüße zu und überprüfen Sie das Fehlen von palpebrale Reflexe an den Augen durch Berühren der medialen Augenwinkel des Auges. Hinweis: Intraperitoneale Injektion von Ketamin ist eine häufig verwendete Alternative zu inhalierten Isofluran.</li>
	<li>Um den Ischiasnerv freizulegen, rasieren Sie die Haare von den Hind limb(s) und reinigen Sie die rasierten Bereiche mit 70 % Ethanol. Mit einem Skalpell oder einer Schere, machen einen 2-3 cm Einschnitt in die Haut entlang der hinteren Gliedmaßen vom Knie bis zu den Trochanter Major, wo Palpation des Oberschenkelknochens mit dem sterilen Skalpell um die richtige Position des Schnittes zu gewährleisten. Das Femur befindet sich nur auf das zugänglichste Segment des Nervus ischiadicus proximal. Obwohl dies eine Operation nicht überleben wird, pflegen Sie sterile Techniken.</li>
	<li>Nach dem vornehmen der hautinzision, suchen Sie das Flugzeug zwischen den Muskel Bizeps Femoris und den Musculus Muskel, und mit Mikrodissektion Schere trennen die zugrunde liegenden Faszie und setzen 2-3 cm des Nervus ischiadicus unterstreichen. Um eine klare Abschnitt des n. ischiadicus verfügbar zu machen, verwenden Sie einen Retraktor, um die Kluft zwischen den beiden Muskeln (Abbildung 1A) zu vergrößern. Trennen Sie mit feinen Zangen und Iris Schere vorsichtig den Nerv aus den umliegenden Bindegewebes, unter größter Sorgfalt nicht zu komprimieren oder Schnitten den Nerv.</li>
	<li>Fügen Sie ausreichend Trump Fixativ (4 % Formaldehyd, 1 % Glutaraldehyd mit 1 X PBS-Puffer (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) mit 1,16 g NaH2PO4· H2O pro 100 mL) in den Hohlraum mit exponierten Nervs Nervus abdecken und 10 Minuten ruhen lassen. Wenn nötig, Platz Gaze unter der Hind Bein, um den Winkel zu verbessern, so dass mehr Fixiermittel in den Hohlraum hinzugefügt werden kann. Entfernen Sie das Fixiermittel nach 10 Minuten und wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.</li>
	<li>Mit einem sezierenden Mikroskop schnitten den Nerv von beiden Seiten mit feinen Dissektion Schere, sicherstellen, dass nicht zu dehnen oder zu kneifen der Ischiasnerv und sofort die Nerven-Abschnitte in 15 mL Röhrchen mit Trumps Fixiermittel bei 4 ° C für eine Woche, Ändern der Fixiermittel alle 48 h.</li>
	<li>Nicht unbeaufsichtigt lassen Tiere während eines Teils des chirurgischen Eingriffs. Nach der Entfernung des Nervs einschläfern Sie Tiere durch zervikale Dislokation unter Narkose.</li>
</ol>(2) Osmium ausgefällt Behandlung und Harz einbetten
<ol><li>Post-Fixierung, sorgfältig entfernen Sie alle verbleibenden Fett und Bindegewebe vom Nerv und mit einem scharfen Skalpell schnitten den Nerv in Segmente ca. 5 mm in der Länge (Nerv Segmente getrennt und in verschiedene Leitungen gekennzeichnet werden können). Bereiten Sie frische 2 % Osmium ausgefällt in Trumps Fixativ Lösung verdünnt und halten in einer Glasröhre. Tauchen Sie Nerven Segmente in 2 % Osmium ausgefällt für 2 h, die im Kunststoff-Rohre für diesen kurzen Zeitraum der Zeit sein kann. Hinweis: Einige Kunststoffrohre reagieren mit Osmium ausgefällt, verursacht eine Verdunkelung der Lösung, daher längerer Lagerung von Osmium ausgefällt in Kunststoffrohren nicht empfohlen.</li>
	<li>Mit einer Epoxy Einbettung mittlere Kit, bereiten Sie die endgültige Einbettungs-Formel:<ol>
<li>Mischen Sie das Epoxidharz einbetten Medium mit DDSA-Lösung (Dodecenylsuccinic-Anhydrid; Mischung A) und mischen Sie das Epoxidharz einbetten Medium mit NMA-Lösung (Methylnadic-Anhydrid; Mischung B). Lassen Sie beide Mischungen, die A und B mindestens 20 min durch Rühren mit einem Magnetrührer mischen.</li>
		<li>Unmittelbar vor der Anwendung mischen Sie A und B-Mischung und fügen Sie das Gaspedal DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) im Verhältnis von 1,5 bis 2,0 % des Gesamtvolumens des Gemisches. Beachten Sie, dass die DPM-30 Lösung gemessen werden sollte, gerade um zu verhindern, dass den Block immer dunkel in der Farbe und spröde. Alle Harz-Chemikalien sind giftig; seien Sie besonders vorsichtig, Hautkontakt oder Inhalation zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit 1,5 mL-Tuben, Nerv Segmenten mit PBS waschen und die Austrocknung zu starten, indem man die Nerv Segmenten in verschiedenen Aceton/destilliertes Wasser Passagen: 30 %, 60 %, 90 %, Konzentrationen für 10 min, dann in 100 % Aceton 3 Mal für 10 Minuten.  Beachten Sie, dass Ethanol anstelle Aceton verwendet werden kann.</li>
	<li>Platzieren Sie für Harz Infiltration den Nerv Segmenten in einer Mischung aus 1 Teil der abschließenden Einbettung Mischung und 1 Teil 100 % Aceton für 30 min, dann in einer Mischung aus 2 Teilen der abschließenden Einbettung Mischung und 1 Teil 100 % Aceton für 30 min , und schließlich der Nerv im Finale Segmenten Platz Einbettung Mischung für 30 Minuten.</li>
	<li>Silikon-Kautschuk Einbettung Formen die Nerv Segmenten umgesetzt (wir haben 106 mm Länge x 71 mm Breite x 7 mm Tiefe verwendet; Blocklänge Größe 11 mm x 6 mm Breite x 3 mm Tiefe). Fügen Sie sanft das Harz auf die Nerven, und achten Sie auf decken die gesamten Nerv Segmenten und verhindern, dass Luftblasen. Lassen Sie die Form mit Nerv Segmenten mit dem Harz über Nacht bei 60 ° C polymerisieren.</li>
</ol>3. Schnitt durch regungsloses
<ol><li>Bereiten Sie Glas Messer mit einer Glas-Messermacher (Abbildung 1 b) und machen Sie Glas Messer mit Booten (Abbildung 1), die verwendet werden, auf das destillierte Wasser schwimmenden Nerv zu sammeln.</li>
	<li>Ort Harz eingebettet Nervenblockaden in regungsloses Halter mit der trapezförmige Seite nach oben. Mit regungsloses Rahmen, kein überschüssiges Harz rund um das Nervengewebe zu trimmen, und den Block eine Trapezform Gesicht und möglichst nahe an der längs-Oberfläche des Nervs wie möglich mit einer einseitig geschliffenen Klinge wie eine Rasierklinge. Dringen Sie nicht längs Oberfläche des Segments Nerv, die erkennbar durch seine dunkle Färbung von Osmium ausgefällt. Hinweis: Trimmen des überschüssigen Harzes verringert sich das Gebiet des Harzes werden geschnitten und Leistung der Blade und schneiden in den nachfolgenden Schritten verbessern.</li>
	<li>Mit der regungsloses stellen Sie mehrere Querschnitte ausreichend, um eine gleichmäßige Querschnitt Oberfläche des Nervengewebes mit einem einfachen Glas-Messer verfügbar zu machen. Sobald dies geschehen ist, wechseln Sie zu einem Glas Messer, dessen Schiff mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gefüllt ist, und passen Sie die regungsloses, 1-2 μm dünne Abschnitte geschnitten.</li>
	<li>Übertragen Sie schwimmende Dünnschliffe aus dem Glas-Messer-Boot zu einem Rückgang von entionisiertem Wasser auf Objektträger mit Metallöse (Abbildung 1). Trocknen Sie Folien mit Abschnitten, indem man mehrere Male über einer Flamme für ein paar Sekunden, und achten Sie nicht auf die Abschnitte zu überhitzen. Getrocknete Teile sofort mit Toluidin blauer Fleck oder für mehrere Tage vor der Färbung bei Raumtemperatur lagern. Hinweis: Abschnitte können auch mit einer Warmhalteplatte bei 60 ° C für 15 min getrocknet werden. Eine langsame Trocknung macht die Abschnitten glatt.</li>
</ol>4. Toluidin blauer Färbung
<ol><li>Bereiten Sie 1 % ige Lösung von Toluidin blau durch 2 g Natrium Borat in 100 mL entionisiertem Wasser auflösen dann fügen Sie 1 g Toluidin blau hinzu und rühren Sie, bis aufgelöst. Filtern Sie die Lösung mit Filterpapier (Porengröße: 11 µm) und halten Sie die Lösung in eine undurchsichtige Flasche bei Raumtemperatur bis zu zwei Wochen.</li>
	<li>Mit einem Kunststoff-Pipette oder Mikro-Pipette, einen Tropfen Toluidin blau Lösung oben auf der Nerv-Abschnitte und lassen für 20-30 s.</li>
	<li>Spülen Sie alle überschüssige Toluidin blau-Lösung durch die Folien in entionisiertem Wasser Glas sanft eintauchen und wiederholen Sie 3-4 Mal, bis Abschnitte klar sind. Trocknen Sie die Folien mindestens 15 min bei 60 ° C oder über Nacht bei Raumtemperatur und dann bedecken Sie die Abschnitte mit einem deckgläschen mit regelmäßigen Eindeckmedium. Untersuchen Sie die gerahmten Dias sofort oder bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop. A 100 X Öl Immersion-Objektiv empfiehlt sich für detaillierte Bilder verwendet, um g-Werte zu berechnen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development:+What+small+animal+models+can+tell+us.">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li><li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury:+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies.">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li><li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation.">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+part+II-morphological+techniques.">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach.">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li><li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue+and+Lugol's+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy.">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 21, 160-163 (1992).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering.">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li><li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).</li><li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits:+A+systematic+review.">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li><li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+uses+and+methods+of+processing+of+fresh+frozen+sections+of+peripheral+nerve.">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li><li>Castro, J., Negredo, P., Avenda&#241;o, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode.">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+Part+II-morphological+techniques.">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li><li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., B&#246;cker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves.">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li><li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+nerve+biopsies:+A+practical+guide+for+neuropathologists.">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li><li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration.">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li><li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+staining+methods+for+resin-embedded+peripheral+nerve.">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li><li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+immunohistochemistry+on+improved+glycol+methacrylate-resin+sections.">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li><li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+stains:+A+literature+review+and+case+study.">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li><li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+and+nonporous+nerve+conduits:+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety.">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li><li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits.">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte.

Untersuchungen der morphologischen Strukturen der periphere Nervenverletzung und Regeneration sind häufige Themen der Studie13. In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte, um Bilder in hoher Qualität für histologische Daten Quantifizierungen mit Ratte Ischias-Nervengewebe eingebettet in Harz Blöcken und gefärbt mit Toluidin blau zu erhalten. Diese Technik bietet ein Bild der Nerv Morphologie der Nervenregeneration durch Messung der Zahl von Axonen, Grad der Myelinisierung, Vorhandensein...

Periphere Nerven erstrecken sich im ganzen Körper, innervieren Zielgeweben mit motorischen oder sensorischen Axonen1. Periphere Nerven Mängel verursacht durch Erkrankungen und Trauma eine große Gesundheitsproblem darstellen und haben große wirtschaftliche Auswirkungen2,3. Trotz der Fortschritte bei der Bewertung der Ergebnisse der peripheren Nervenverletzungen und Verständnis Nervenregeneration sind traditionelle Methoden wie Nerven Histologie und Färbetechniken wesentliche Instrumente, um qualitativ und quantitativ Nerven Gesundheit bewerten als terminal Ausgang Maß in Tiermodellen oder ausgeschnittenen menschliches Gewebe. Dies ist oft mit elektrophysiologische Messungen der peripheren Nervenfunktion, gepaart wo Morphometrie offenbaren kann, warum funktionelle Nervenregeneration habe oder nicht auftreten.
Toluidin blauer Färbung der Harz eingebettet Semi-dünne periphere Nerven Abschnitte ist eine spezielle Methode für imaging Markhaltige Nervenfasern, qualitativ hochwertige und klare detaillierte Bilder von Nerv Strukturen4,5,6 . Toluidin blau ist ein acidophilen metachromatic Fleck, von William Henry Perkin im Jahre 18567, entdeckt und wurde in mehreren medizinischen Anwendungen8verwendet. Toluidin blau gefärbten peripheren Nerven Abschnitte gewonnenen Harz eingebettet Nerv Segmenten ermöglicht eine übersichtliche Visualisierung von Nervenstrukturen. Visualisierung der Myelinscheide Struktur kann durch die Verwendung von Osmium ausgefällt Post-Fixierung4,9verbessert werden. Osmium ausgefällt ist eine toxische Oxidationsmittel und Lipid Fixativ Agent, die Interaktion mit den Doppelbindungen in Lipiden, was zu krass definierten lipidreichen Myelinscheiden10. Jedoch Osmium ausgefällt ist giftig, teuer, erfordert eine längere Inkubationszeit der Nerv Segmenten und wird nicht immer verwendet.
Zur Visualisierung der peripheren Nerven Morphologie wurden alternative Methoden der Verarbeitung und Färbung entwickelt; Paraffin, Kryo-Schnitt und Epoxy-Harz eingebettet Nerv Schnitt gefolgt von Färbungen mit Toluidin blau oder Phenylendiamin Lösung verwendet wurde, um morphologische Veränderungen der peripheren Nerven Regeneration 11,12 zu quantifizieren . Jede dieser Methoden haben ihre vor- und Ertragsdaten wesentlich von der Anzahl der Axone, Myelin Dicke, Axon Durchmesser und Axon Durchmesser Markhaltige Faser Durchmesser (g-Wert) 11,13,14,15 .
Der primäre Unterschied der Harz-Einbettung in diesem Protokoll ist, dass es 1-2 μm Dicke Querschnitte aufgrund der Härte des Harzes erleichtert unter Beibehaltung der histologischen Eigenschaften des Nervs zu erhalten. Diese dünne Abschnitte, im Gegensatz zu den 4-5 μm Dicke Abschnitte von Paraffin einbetten, erhalten bieten peripheren Nerven Abschnitte mit höherer Auflösung, so dass für eine genaue Quantifizierung der Axon Myelinisierung, wie der g-Wert, die nicht aus dickeren Abschnitte16gewonnen. Während Kryo-Schnitt verwendet werden kann um 1-2 µm Abschnitte zu erhalten, ist es unserer Erfahrung gewesen, ist es schwieriger, ohne zahlreiche große Risse zu bekommen. Solche Risse Abschnitte kann ungenau zählen die Anzahl der Axone und Aspekte der Myelinisierung.
Neben Toluidin Blau Färbung17eine silberne Färbung Methode18 und Masson trichrome Färbung4 auch einsetzbar, Nervenzellen Axone zu zeigen. Jedoch gebeizt mit Harz Einbettung der Ratte n. medianus Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin oder Masson trichrome zeigte schwache Myelinscheiden und unbekannte Strukturen, während Toluidin blauer Färbung klar Myelinscheide Bild zeigte und kann leicht quantifizierte4sein. Trotz einiger Einschränkungen Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet peripheren Nerven ist eine wertvolle Technik, die verwendet werden kann, wenn Bilder mit hoher Auflösung der Nerv Morphologie erforderlich sind.
Der primäre Nachteil für die Einbettung von Harz ist, dass es zeitaufwendig ist und nicht für Immunostaining des gleichen Gewebes aufgrund der Schwierigkeiten der Antigen-Retrieval gegenüber Paraffin und eingebettete Gefrierschnitte Techniken zu ermöglichen. So kann es nicht im Allgemeinen das gleiche Gewebe für Immunostaining zu nutzen, die über Harz-Einbettung für Toluidin blauer Färbung verarbeitet wird. Obwohl nicht verwendet hier ggf. Immunohistochemistry im Harz eingebettete Abschnitte, die Verwendung von Glykol Methacrylat Einbettung Harze ermöglicht Immunohistochemistry Gewebeschnitte ausgeführt werden, aber es ist relativ teuer19. Dies kann etwas gemildert durch Einschneiden der peripheren Nervs, separate Segmente, einige für die Einbettung von Harz und andere für Immunostaining direkt nach der Fixierung.
Der Prozess der Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet periphere Nerven, wie mit die meisten histopathologische Analyse in fünf Stufen, einschließlich Fixierung, Austrocknung, einbetten, schneiden und färben20unterteilt werden kann. Hier wollen wir ein Protokoll und einen praktischen Leitfaden für die Verwendung von Harz eingebettete Ratte Ischiasnerv Abschnitte gebeizt mit Toluidin blau erwerben Bilder in hoher Qualität bieten.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffer Saline</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Tetraborate Decahydrate</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Embedding Medium Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>To adjust Trump&#039;s fixative pH</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Chemical</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Embedding Cast</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knife Maker</td><td>RMC Products</td><td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC Products</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 mL Glass Vial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>For trimming resin block</td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70944</td><td>For picking up thin resin sections</td></tr><tr><td>Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>100 Watt Oven</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>6350115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filter Paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL plastic pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr><tr><td>Micro-surgical Kit</td><td>World precision instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus fluorescence microscope</td><td></td><td></td><td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td></tr></tbody></table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

Periphere Nerven erstrecken sich im ganzen Körper, innervieren Zielgeweben mit motorischen oder sensorischen Axonen. Aufgrund der weiten Verbreitung sind periphere Nerven häufig wegen Verletzung oder Krankheit beschädigt. Methoden und Strategien entwickelt wurden, um periphere Nervenverletzung in Tiermodellen, Funktion und Regeneration, bewerten analysieren die Morphometrie der peripheren Nerven ein wesentliches Ergebnis der terminal-Messung geworden ist. Toluidin blauer Färbung des Nervs Kreuz Abschnitte gewonnenen Harz eingebettet Nerv Abschnitte ist eine reproduzierbare Methode für die qualitative und quantitative Beurteilung der peripheren Nerven, ermöglicht die Visualisierung der Morphologie Anzahl der Axone und Grad der Myelinisierung. Diese Technik kann wie bei vielen anderen histologischen Methoden schwierig sein zu erlernen und zu beherrschen, mit schriftlichen Standardprotokolle. Die Absicht dieser Veröffentlichung ist daher um schriftliche Protokolle für Toluidin blauer Färbung der peripheren Nerven mit Videografie von der Methode, bei der Ischias Nerven geerntet von Ratten zu betonen. In diesem Protokoll beschreiben wir in Vivo peripheren Nerven Fixierung und Sammlung der Gewebe und Post-Fixierung mit 2 % Osmium ausgefällt, Einbettung von Nerven in Epoxidharz und regungsloses Nerven 1-2μm Dicke schneiden. Nerv Abschnitte dann auf einen Objektträger übertragen und gefärbt mit Toluidin blau, woraufhin sie quantitativ und qualitativ bewertet werden. Beispiele für die häufigsten Probleme sind sowie Schritte zur Eindämmung dieser Probleme angezeigt.

Harz eingebettet peripheren Nerven Abschnitte mit Toluidin blau gebeizt für genaue histologische Daten Quantifizierungen ermöglichen. Ein Überblick über das Verfahren zeigt (Abbildung 2). Ischias-Nerven-Abschnitte in Harz Medium eingebettet und befleckt mit Toluidin blau zeigte klare Bilder mit einer optimalen Auflösung (Abb. 3). Nervenschäden kann viele Veränderungen in Nervenzellen morphologische Strukturen, z. B. Veränderungen der ...

Watch this Scientific Journal Video about Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology at JoVE.com

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die feinen Strukturen des peripheren Nerven visualisieren und 1-2 µm Abschnitte mit Toluidin blauer Färbung

Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet Abschnitte für die Beurteilung der Morphologie der peripheren Nerven

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.7K Aufrufe.  University of Wyoming. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die feinen Strukturen des peripheren Nerven visualisieren und 1-2 µm Abschnitte mit Toluidin blauer Färbung

Serie: Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Bewertung der Ultrastrukturforschung Neuroplastizität Parameter nach In Utero Transduktion von Entwicklungsländern Mausgehirn und Rückenmark

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Entwicklungsbiologie

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Optische Überwachung der Lebensnervenendigung Beschriften in Haarfollikel Lanceolate Endigungen der<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus-Ohr-Haut

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to degeneration and injury of small-diameter sensory neurons, referred to as small fiber neuropathy. Present animal models of small fiber neuropathy affect both large- and small-diameter sensory fibers and thus create a neuropathology too complex to properly assess the effects of injured small-diameter sensory fibers. Therefore, it is necessary to develop an experimental model of pure small fiber neuropathy to adequately examine these issues. This protocol describes an experimental model of small fiber neuropathy specifically affecting small-diameter sensory nerves with resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), through a single dose of intraperitoneal injection, referred to as RTX neuropathy. This RTX neuropathy showed pathological manifestations and behavioral abnormalities that mimic the clinical characteristics of patients with small fiber neuropathy, including intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specifically injury in small-diameter neurons, and induction of thermal hypoalgesia and mechanical allodynia. This protocol tested three doses of RTX (200, 50, and 10 &#181;g/kg, respectively) and concluded that a critical dose of RTX (50 &#181;g/kg) is required for the development of typical small fiber neuropathy manifestations, and prepared a modified immunostaining procedure to investigate IENF degeneration and neuronal soma injury. The modified procedure is fast, systematic, and economic. Behavioral evaluation of neuropathic pain is critical to reveal the function of small-diameter sensory nerves. The evaluation of mechanical thresholds in experimental rodents is particularly challenging and this protocol describes a customized metal mesh that is suitable for this type of assessment in rodents. In summary, RTX neuropathy is a new and easily established experimental model to evaluate the molecular significance and intervention underlying neuropathic pain for the development of therapeutic agents.

This study establishes an experimental model of pure small fiber neuropathy with resiniferatoxin (RTX). A unique dose of RTX (50 &#181;g/kg) is optimal for developing a small fiber neuropathy model that mimics patient characteristics and could help investigate the nociceptive molecular significance underlying neuropathic pain.

Einrichtung ein Mausmodell eine reine kleine Faser Neuropathie mit Ultrapotent Agonisten von transienten Rezeptor Potential Vanilloid Typ 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Ethanol-Induced Cervical Sympathetic Ganglion Block Applications for Promoting Canine Inferior Alveolar Nerve Regeneration Using an Artificial Nerve

Polyglycolic acid collagen (PGA-C) tubes are bio-absorbable nerve tubes filled with collagen of multi-chamber structure, which consist of thin collagen films. Favorable clinical outcomes have been achieved when using these tubes for the treatment of damaged inferior alveolar nerve (IAN). A critical factor for the successful nerve regeneration using PGA-C tubes is blood supply to the surrounding tissue. Cervical sympathetic ganglion block (CSGB) creates a sympathetic blockade in the head and neck region thus increasing blood flow in the area. To ensure an adequate effect, the blockade must be administered with local anesthetics one to two times a day for several consecutive weeks; this poses a challenge when creating animal models for investigating this technique. To address this limitation, we developed an ethanol-induced CSGB in a canine model of long-term increase in blood flow in the orofacial region. We examined whether IAN regeneration via PGA-C tube implantation can be enhanced by this model. Fourteen Beagles were each implanted with a PGA-C tube across a 10-mm gap in the left IAN. The IAN is located within the mandibular canal surrounded by bone, therefore we chose piezoelectric surgery, consisting of ultrasonic waves, for bone processing, in order to minimize the risk of nerve and vessel injury. A good surgical outcome was obtained with this approach. A week after surgery, seven of these dogs were subjected to left CSGB by injection of ethanol. Ethanol-induced CSGB resulted in improved nerve regeneration, suggesting that the increased blood flow effectively promotes nerve regeneration in IAN defects. This canine model can contribute to further research on the long-term effects of CSGB.

We evaluated the effect of cervical sympathetic ganglion block on nerve repair using artificial nerve conduits. Male beagle dogs were each implanted with an artificial nerve across a 10-mm gap in the left inferior alveolar nerve; left cervical sympathetic ganglion was blocked by injecting 99.5% ethanol via lateral thoracotomy.

Ethanol-induzierte zervikalen sympathischen Ganglion Block-Anwendungen für die Förderung der Eckzahn minderwertig alveoläre Nervenregeneration mit einer künstlichen Nerv

Polyglycolic acid collagen (PGA-C) tubes are bio-absorbable nerve tubes filled with collagen of multi-chamber structure, which consist of thin collagen ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...