저자는 thankthe 젠킨스 현미경 시설 그들의 도움과 멤버 Bushman 실험실의 켈리 Roballo, 헤이든 진정한, Wupu Osimanjiang, Subash Dhunghana, 동물 보호에 대 한 와이오밍 대학에서 하 고 싶습니다. 이 게시가 되었습니다 기관 개발 상 수상 (IDeA는)에 의해 국립 과학 연구소에서의 일반 의료의 부여 # 2P20GM103432에서 건강의 국가 학회.

성인 Sprague Dawley 쥐가이 프로젝트에 사용 된 및 모든 절차 와이오밍 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1. 수술 및 생체 내 신경 고정
참고: 모든 자료와 장비가이 프로토콜에 대 한 공급 업체 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
참고: vivo에서 신경 고정 조직을 보존 하 고 죽음의 시간과 신경의 컬렉션 간에 발생할 수 있는 구조적 성능 저하를 줄일 데 사용 됩니다. 조직의 고정 vivo에서 종종이 전조의 관류는 조직학, 신경 조직의 준비에 대 한 표준 연습 이다. 배치 하 고 원래의 장소에 고정을 위한 허용 주변 신경의 크기. 우리가 수집 및 조직 저하의 가능성으로 인해 안락사 후 조직의 정착을 권장 하지 않습니다.
<ol><li>2-3 %isoflurane 유도 챔버에 그것을 배치 하 여 전신 마 취에 대 한 쥐를 준비 다음 마 취 쥐 해 부 매트 위에 발생 하기 쉬운 위치에 놓고 isoflurane 마 취 코 콘을 통해의 1-2%에서 유지 합니다. 마 취의 적절 한 깊이 보장 하기 위해, 뒷 발에 페달 철수에 대 한 동물을 테스트 하 고는 법 눈으로 눈에서 종을 반사의 부재에 대 한 확인 합니다. 참고: 마 취 제의 복 주입 흡입된 isoflurane에 일반적으로 사용 되 대안 이다.</li>
	<li>좌 골 신경, 노출 하는 hind limb(s)의 머리를 면도 하 고 70% 에탄올과 면도 영역을 청소. 메스와가 위, 큰 trochanter까지 무릎에서 뒷 다리 따라 피부에 2-3cm 절 개를 하 게 어디 절 개의 적절 한 위치를 보장 하기 위해 살 균 메스를 사용 하 여 대 퇴 골의 촉진. 대 퇴 골은 그냥 근 좌 골 신경의 가장 접근 가능한 세그먼트에 위치 합니다. 비록이 아닌 생존 수술, 무 균 기법을 유지 합니다.</li>
	<li>피부 절 개 후, 팔 뚝 femoris 근육과 대 둔 근 근육 사이 비행기 찾아서 서가 위를 사용 하 여 기본 근 막 분리 및 밑줄 좌 골 신경의 2-3 cm를 노출 합니다. 좌 골 신경의 명확한 섹션 노출, 두 근육 (그림 1A) 사이의 격차를 확대 하는 견인을 사용 합니다. 좋은 집게와 아이리스가 위, 결합 조직, 압축 또는 신경을 잘라 큰 돌 주변에서 신경 분리 신중 하 게.</li>
	<li>충분 한 트럼프의 정착 액 (4% 포름알데히드, NaH2PO4·의 1.16 g 1 x PBS (인산 염 버퍼 식 염 수)에서 1%도 추가 100 mL 당 H2O) 포함 하는 신경을 커버 하 고 10 분 동안 앉게 하 노출된 신경 구멍으로. 더 많은 정착 액 캐비티에 추가할 수 있도록 각도 개선 하기 위해 필요한 장소 거 즈는 뒷 다리 아래 다리 경우. 10 분 후에 정착 액을 제거 하 고 두 번 이상이 단계를 반복.</li>
	<li>해 현미경을 사용 하 여 정밀한 해 부가 위, 스트레칭 또는 좌 골 신경 핀치를 하지를 사용 하 여 양쪽에서 신경 자르고 즉시 신경 섹션 변경 1 주일에 4 ° C에서 트럼프의 정착 제를 포함 하는 15 mL 튜브에 넣고는 정착 액 모든 48 h입니다.</li>
	<li>두지 마십시오 동물 무인 수술의 일부. 신경의 제거 후, 마 취하에 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 안락사.</li>
</ol>2. 오스뮴 Tetroxide 치료 및 수 지 포함
<ol><li>고정 게시, 신중 하 게 모든 나머지 지방과 결합 조직 신경에서 제거 하 고 날카로운 메스를 사용 하 여 세그먼트 길이 (신경 세그먼트 구분 될 수 있으며 다른 튜브에 표시)에 약 5 mm 신경을 잘라. 신선한 2% 오스뮴 tetroxide 트럼프의 통 솔루션에 희석을 준비 하 고 유리 튜브에 계속. 시간이 짧은 기간에 대 한 플라스틱 튜브에 있을 수 있는 2 시간에 대 한 2% 오스뮴 tetroxide 신경 세그먼트를 담가. 참고: 일부 플라스틱 튜브 오스뮴 tetroxide 플라스틱 튜브에의 장기간된 보관 권장 하지 않습니다 그래서 솔루션, 어둡게 일으키는 오스뮴 tetroxide와 반응.</li>
	<li>매체 키트를 포함 하는 에폭시를 사용 하 여 최종 포함 수식을 준비:<ol>
<li>DDSA 솔루션 (dodecenylsuccinic 무수 물, 혼합물 A) 매체를 포함 하는 에폭시를 혼합 하 고 혼합 NMA 솔루션 (methylnadic 무수 물, 혼합물 B) 매체를 포함 하는 에폭시. A와 B는 자력으로 교 반에 의해 적어도 20 분을 섞어 두 혼합물을 하자.</li>
		<li>사용 직전 혼합 A와 B를 혼합 하 고 추가 가속기 DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) 혼합물의 총 볼륨의 1.5 ~ 2.0%의 비율에. Note DPM 30 솔루션 어두운 색상 및 취 성 되는 블록을 방지 하기 위해 정확 하 게 측정 되어야 한다. 모든 수 지 화학 물질이 독성; 피부 접촉 또는 흡입을 방지 하기 위해 여분의 주의 분리 했습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL 튜브를 사용 하 여 PBS 가진 신경 세그먼트를 세척 하 고 다른 아세톤/증 류 물 구절에 신경 세그먼트를 배치 하 여 탈수 과정을 시작: 30%, 60%, 90%, 10 분 각, 다음 3 시간 10 분 대 한 100% 아세톤에 농도.  Note는 에탄올 아세톤 대신 사용 될 수 있다.</li>
	<li>수 지 침투에 대 한 배치 최종 포함 혼합물의 1 개 부품의 혼합물에서 신경 세그먼트 및 최종 포함 혼합물의 2 개 부품의 혼합물 및 30 분 1 부분 100% 아세톤에서 30 분, 1 부분 100% 아세톤 및 장소 신경 세그먼트는 마지막에 30 분을 위한 혼합물을 포함 하는 마지막으로.</li>
	<li>실리콘 고무 금형 포함으로 신경 세그먼트를 넣어 (우리 x 7 mm 깊이 x 71 mm 폭 106 m m 길이 사용 하는, 크기 11 m m 길이 6 m m 폭 3 mm 깊이 x x 차단). 부드럽게 전체 신경 세그먼트를 커버 하 고 기포를 만들기 방지 하는 신경 위에 수 지를 추가 합니다. 60 ° C에서 하룻밤 유해를 수 지로 신경 세그먼트를 포함 하는 금형을 둡니다.</li>
</ol>3. Ultramicrotome에 의해 단면
<ol><li>유리 칼은 유리 칼 메이커 (그림 1B)를 사용 하 여 준비 하 고 보트 (그림 1C), 증 류 된 물에 떠 있는 신경 섹션을 수집 하는 데 사용 되는 유리 칼.</li>
	<li>포함 된 수 지 신경 블록을 사다리꼴 면이 위로 향하도록 ultramicrotome 홀더에 넣으십시오. 주변 신경 조직을 어떤 과잉 수 지 트림 ultramicrotome 범위를 사용 하 고 블록 사다리꼴 모양 얼굴 그리고 면도날 같은 단일 깨끗 블레이드를 사용 하 여 가능한 신경의 경도 표면에 가까이. 오스뮴 tetroxide에 의해 그것의 어두운 얼룩에 의해 인식할 수 있는 신경 세그먼트의 경도 표면을 침투 하지 않습니다. 참고: 과잉 수 지의 조정 구분 될 블레이드 성능 및 후속 단계에 절단을 개선 하는 수 지의 영역을 줄이는 것입니다.</li>
	<li>ultramicrotome를 사용 하 여 여러 횡단면 일반 유리 칼을 사용 하 여 신경 직물의 일정 한 횡단면 표면 노출 하기에 충분 한 확인 합니다. 이 완료 되 면, 그의 보트는 상 온에서 증류수 가득 유리 칼으로 전환 하 고 얇은 섹션을 1-2 μ m ultramicrotome 조정 합니다.</li>
	<li>금속 루프 (그림 1D)를 사용 하 여 유리 슬라이드에 유리 칼 보트에서 이온된 물 한 방울 떠 있는 얇은 섹션을 전송. 섹션을 과열 하지 않도록 하는 몇 초 동안 화 염에 여러 번 전달 하 여 섹션을 포함 하는 슬라이드를 건조. 톨루이와 즉시 건조 섹션 블루 얼룩 또는 얼룩 전에 몇 일 동안 실내 온도에 저장. 참고: 섹션 수 있습니다 또한 건조 15 분 동안 60 ° C에서 따뜻한 접시를 사용 하 여. 느린 건조 과정 섹션 부드러운 게.</li>
</ol>4. 톨루이 블루 얼룩
<ol><li>2g의 나트륨 붕 산 염 이온을 제거 된 물 100 mL에 용 해 하 여 톨루이 블루의 1% 솔루션 준비 다음 톨루이 블루의 1 g을 추가 하 고 해산 때까지 휘저어. 필터 종이 사용 하 여 솔루션을 필터링 (기 공 크기: 11 µ m) 최대 2 주 동안 실내 온도에 불투명 한 병에 솔루션을 계속 하 고.</li>
	<li>플라스틱 피 펫 또는 마이크로 pipettor 사용 하, 신경 섹션 상단 톨루이 블루 솔루션의 한 방울을 추가 하 고 20-30 s에 대 한 둡니다.</li>
	<li>부드럽게 찍기 이온된 물 항아리에 슬라이드에 의해 초과 모든 톨루이 블루 솔루션에서 헹 구 고 섹션 분명 때까지 3-4 회 반복. 슬라이드에 15 분 또는 60 ° C에서 하룻밤 실 온에서 건조 하 고 섹션 coverslip 일반 설치 매체를 사용 하 여 커버. 탑재 된 슬라이드를 즉시 검사 하거나 상 온에서 저장 합니다.</li>
	<li>가벼운 현미경 검사. 100 X 기름 침수 렌즈 g-비율을 계산 하는 데 사용 하는 자세한 이미지에 대 한 것이 좋습니다.</li>
</ol>

<ol>
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M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits.">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).</li></ol>

저자 들은 관심 없음 충돌 선언 합니다.

주변 신경 손상 및 재생의 형태학 적 구조 시험 연구13의 빈번한 주제는. 이 프로토콜에서 우리 조직학 데이터 quantifications 쥐 좌 골 신경 조직 수 지 블록에 포함 된 및 톨루이 파랑 스테인드를 사용 하 여에 대 한 높은 품질의 이미지를 얻을 수 있는 단계를 설명 합니다. 이 기술은 신경 형태학 축 삭의 수, myelination, infiltrative 거리 조직의 존재와 건강 신경의 정도 측정 하 여 신경 ...

주변 신경 모터 또는 감각 축 삭1대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 의료 장애로 인 한 말 초 신경 결함 외상 중요 한 공중 위생 관심사를 대표 하 고 큰 경제적 파급 효과2,3. 주변 신경 상해의 결과 평가 하 고 신경 재생을 이해에 있는 전진에도 불구 하 고 전통적인 방법 신경 조직학 등 기법을 얼룩이 지는 질적 및 양적 평가 신경 건강에 필수적인 도구 으로 동물 모델 또는 삭제 인간의 조직에 터미널 결과 측정. 이것은 종종 morphometry 기능 신경 재생 않았거나 발생 하지 않은 이유를 밝힐 수 있다 주변 신경 기능의 electrophysiological 측정와 결합 됩니다.
톨루이 블루 이미징 myelinated 신경 섬유, 높은 품질을 제공 하는 전문적인 방법 포함 수 지 주변 신경 반 얇은 섹션의 얼룩이 지 고 신경 구조4,5,6의 상세한 이미지를 지우기 . 톨루이 블루 acidophilic metachromatic 얼룩, 18567, 윌리엄 헨리 Perkin에 의해 발견 이며 여러 의료 응용 프로그램8에서 사용 되었습니다. 톨루이 블루 스테인드 주변 신경 섹션 수 지 포함 신경 세그먼트에서 얻은 신경 구조의 명확한 시각화 수 있습니다. Myelin 칼 집 구조 시각화 오스뮴 tetroxide 후 고정4,9를 사용 하 여 향상 될 수 있습니다. 오스뮴 tetroxide은 독성 산화 제와 지질 통 에이전트 지질에 이중 결합 상호 작용 starkly 정의 된 지질이 풍부한 myelin 칼 집10인. 그러나, 오스뮴 tetroxide 독성, 비싼, 더 이상 외피 신경 세그먼트의 필요 이며 항상 사용 되지 않습니다.
주변 신경 형태학;의 시각화에 대 한 처리 및 얼룩의 대체 방법은 개발 되었다 파라핀, 극저온 단면, 에폭시 수 지에 포함 된 신경 단면 다음 톨루이 파랑 얼룩 또는 phenylenediamine 솔루션 주변 신경 재생 11,12의 형태학 적 변화를 측정 하는 데 사용 되었습니다. . 이러한 각 메서드는 그들의 이점 및 수율 필수 데이터 축 삭, 수 초 두께, 축 삭 직경 및 myelinated 섬유 직경 (g 비율) 11,,1314,15 축 삭 직경의 수에 .
수 지 포함이 프로토콜의 기본 구분은 그것 신경의 조직학 품질을 유지 하면서 1-2 μ m 두께 횡단면 때문에 수 지의 경도 얻기 용이 합니다. 이러한 얇은 섹션 포함, 파라핀에서 얻은 4-5 μ m 두께 섹션 반대로 주변 신경 축 삭 myelination, g-비율, 수 없는 등의 보다 정확한 정량화에 대 한 높은 해상도 섹션 제공 두꺼운 섹션16에서 얻은. 극저온 단면 1-2 µ m 섹션을 얻기 위해 사용할 수 있는, 그것은 우리의 경험 그것은 수많은 큰 균열 없이 섹션을 얻기 위해 더 어려운 되었습니다. 같은 금이 섹션 축 삭의 수 및 myelination의 측면의 부정확 한 계산을 발생할 수 있습니다.
톨루이 블루17얼룩, 뿐만 아니라 방법18 과 Masson의 trichrome 얼룩4 얼룩은 또한 신경 축 삭 표시를 사용할 수 있습니다. 그러나 반면 톨루이 블루 얼룩 지우기 myelin 칼 집 이미지 그리고 쉽게 중 되며 오신 또는 Masson의 trichrome 보였다 희미 한 myelin 칼 집 및 인식할 수 없는 구조, 스테인드 수 지 쥐 중간 신경 섹션의 포함을 사용 하 여 정량된4수 있습니다. 몇 가지 한계에도 불구 하 고 톨루이 블루 얼룩 포함 된 수 지의 주변 신경 신경 형태학의 고해상도 이미지는 필요한 경우 사용할 수 있는 유용한 기술입니다.
수 지를 포함에 대 한 주요 단점은 그것은 시간이 많이 걸리는 이며 파라핀 및 냉동된 임베디드 섹션 기술에 비해 항 원 복구의 어려움으로 인해 같은 조직의 immunostaining에 대 한 허용 하지 않습니다. 따라서, 일반적으로 수 지-톨루이 블루 얼룩에 대 한 포함을 통해 처리 되는 immunostaining에 대 한 동일한 조직 활용 수 아니다. 비록 하지 immunohistochemistry 바란다면 여기, 사용 수 지에 포함 된 섹션, 글리콜 메타 크 릴 산 수 지를 포함의 사용 허용 immunohistochemistry 조직 섹션에서 수행할 수 있지만 그것은 상대적으로 비싼19. 이 고정 후 직접 별도 세그먼트, 수 지를 포함에 대 한 일부 및 immunostaining에 대 한 다른 사람으로 말 초 신경 절단 하 여 다소 완화 될 수 있습니다.
톨루이 블루 수 지 얼룩이 지기의 과정으로 가장 histopathological 분석, 나눌 수 있습니다 5 단계, 고정, 탈수를 포함 하 여, 포함, 단면, 그리고20얼룩으로 주변 신경, 임베디드. 우리 하고자 여기 톨루이 얻으려고 블루 높은 품질의 이미지와 함께 포함 된 쥐 좌 골 신경 섹션 스테인드 수 지를 사용 하기 위한 프로토콜 및 실용적인 지침을 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1092">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:216px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">14200-075</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glutaraldehyde Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Toluidine Blue O</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:216px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:137px;">205950010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:216px;">Piramal</td>
			<td style="width:137px;">NDC 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Epoxy Embedding Medium Kit</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Hydroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">72068</td>
			<td>To adjust Trump&#39;s fixative pH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Acetone</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:137px;">170942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Osmium Tetroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12545102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Pelco Embedding Cast</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9671811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glass Knife Maker</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">GKM-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">MT-XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">15 mL Conical Tube</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td>ISO 9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">4 mL Glass Vial</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>854190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">55411-050</td>
			<td>For trimming resin block</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Perfect Loop</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">70944</td>
			<td>For picking up thin resin sections</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">100 Watt Oven</td>
			<td style="width:216px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:137px;">6350115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Whatman Filter Paper</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">3 mL plastic pipette</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">Z331740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micro-surgical Kit</td>
			<td style="width:216px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Olympus fluorescence microscope</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

주변 신경와 모터 또는 감각 축 삭 대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 때문에 광범위 한 분포, 주변 신경은 자주 외상 또는 질병으로 인해 손상 됩니다. 방법 및 전략 주변 신경 손상 동물 모델, 기능 및 재생, 평가 하기 위해 개발 된 주변 신경의 morphometry 분석 되고있다 필수적인 터미널 결과 측정. 톨루이 블루 얼룩 신경의 크로스 섹션 포함 수 지 신경 섹션에서 얻은 주변 신경, 시각화 형태학 축 삭의 수와의 사용의 질적 및 양적 평가 대 한 재현 방법 myelination입니다. 이 기술은 다른 많은 조직학 방법, 것과 같이 어려울 수 있습니다 학습과 표준 작성 된 프로토콜을 사용 하 여 마스터. 이 간행물의 의도 톨루이 블루 videography 메서드를 사용 하 여 쥐에서 수확 하는 좌 골 신경의와 주변 신경의 얼룩에 대 한 서 면된 프로토콜을 강조 하 그러므로 이다. 이 프로토콜에서 우리 주변 신경 기정 vivo에서 그리고의 조직, 그리고 2% 오스뮴 tetroxide와 후 고정 컬렉션 설명 에폭시 수 지, 그리고 ultramicrotome 신경 1-2 μ m 두께 단면에서 신경의 포함. 신경 섹션 다음 유리 슬라이드에 전송 하 고 후 그들은 양적 및 질적 평가 톨루이 파란색으로 물. 예는 가장 일반적인 문제는 이러한 문제를 완화 하기 위해 단계 뿐만 아니라 표시 됩니다.

수 지 포함 섹션 톨루이와 파란 얼룩이 허용 정확한 조직학 데이터 quantifications 주변 신경. 절차의 개요는 (그림 2)에 표시 됩니다. 좌 골 신경 섹션 수 지 매체에 포함 된 하 고 최적의 해상도 (그림 3) 톨루이 블루 분명 보여준 이미지와 스테인드. 신경 손상이 발생할 수 있습니다 많은 변화 신경에 형태학 상 구조, 예를 들어 신경 섬유, 축 ...

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Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

여기에 우리가 현재 고 1-2 µ m 섹션 톨루이 블루 얼룩으로 주변 신경의 미세 구조를 시각화 하는 프로토콜

톨루이 블루 주변 신경 형태학의 평가 대 한 수 지에 포함 된 섹션의 얼룩

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.7K 조회수.  University of Wyoming. 여기에 우리가 현재 고 1-2 µ m 섹션 톨루이 블루 얼룩으로 주변 신경의 미세 구조를 시각화 하는 프로토콜

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Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

연구

신경과학

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

골지 콕스 염색과 돌기​​ 형태와 시냅스 연결에 대한 긍정적 인 초기 경험, 촉각 자극의 효과를 시각화

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the diagnosis still relies only on clinical signs of motor involvement that appear later on in the disease course, when most of the dopaminergic neurons are already lost. Hence, there is a strong need for a biomarker that can identify patients at the beginning of disease or at the risk of developing it. Over the last few years, skin biopsy has proved to be an excellent research and diagnostic tool for peripheral nerve diseases such as small fiber neuropathy. Interestingly, a small fiber neuropathy and alpha synuclein (&#945;Syn) neural deposits have been shown by skin biopsy in PD patients. Indeed, skin biopsy has the great advantage of being an easily accessible, minimally invasive and painless procedure that allows the analysis of peripheral nervous tissue prone to the pathology. Moreover, the possibility of repeating the skin biopsy in the course of the follow-up of the same patient allows studying the longitudinal correlation with the disease progression. We set up a standardized reliable protocol to investigate the presence of &#945;Syn aggregates in skin nerve fibers of the PD patient. This protocol involves few short fixation steps, a cryotome sectioning and then a free-floating immunofluorescence double-staining with two specific antibodies: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) to mark the cutaneous nerve fibers and anti 5G4 for detecting &#945;Syn aggregates. It is a versatile, sensitive and easy to perform protocol that can also be applied for targeting other proteins of interest in skin nerves. The ability to mark &#945;Syn aggregates is another step forward to the use of skin biopsy as a tool for establishing a pre-mortem histopathological diagnosis of PD.

Here, we present a protocol for a free-floating indirect immunofluorescence assay on skin biopsy sections that allows for the identification of disease specific conformation variants of alpha synuclein involved in Parkinson disease and multiple proteins of the peripheral nervous system.

자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 Synuclein 응집체를 표적으로 하는

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

쥐에서 만성 이식을 위한 말초 신경 자극 전극의 준비

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

주변 신경 또는 척수 타박상 부상으로 설치류의 기능적 회복을 평가하기 위한 자동 걸음걸이 분석

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...