Diese Methode kann verwendet werden, um die Visualisierung sehr feiner Astrozytenprozesse zur Bewertung von astrozytenneuronalen Wechselwirkungen an der Synapse während krankheits- und stationärer Zustände zu erleichtern. Diese Technik kann auch in jedem Mausmodell, jeder Zellpopulation oder einer Hirnregion angewendet werden. Um eine scharfe Elektrode mit entsprechendem Widerstand vorzubereiten, ziehen Sie eine Borosilikatglas-Einfasselektrode mit einem Filament auf einem Mikropipette-Puller.
Bewahren Sie die gezogenen Elektroden in einem geschlossenen Behälter auf, um zu verhindern, dass Staub in die Spitzen gelangt, und halten Sie die Elektroden von der Unterseite der Box erhöht, um zu verhindern, dass die Spitzen brechen. Um eine Elektrode mit luzifergelber Farbstofflösung zu füllen, legen Sie eine Elektrode in die vertikale Position mit der Spitze nach unten und Pipette ein bis zwei Mikroliter luzifergelbe Lösung in die Rückseite der Elektrode. Warten Sie fünf bis zehn Minuten, bis sich die Lösung über Kapillarwirkung zur Spitze bewegt, bevor Sie die gefüllte Elektrode in einem Elektrodenhalter, der mit einem Manipulator verbunden ist, vorsichtig mit dem Silberdraht des Elektrodenhalters in Kontakt mit dem Luzifergelb in der Elektrode sichern.
Für den Farbstoffauswurftest eine leicht fixierte Hirnscheibe vorsichtig in eine mit 0,1 Molaren PBS gefüllte Glasbodenschale bei Raumtemperatur legen und die Scheibe mit einer Platinharfe mit Nylonsaiten an Ort und Stelle halten. Schließen Sie die Elektrode an eine Spannungsquelle an und legen Sie die Bodenelektrode in das Bad, das die Gehirnscheibe enthält. Bewegen Sie das Ziel eines konfokalen Mikroskops in die von Interesse eingunende Hirnregion und senken Sie die Elektrode mithilfe der 10-fachen Wasser-Tauchlinse in die Lösung, indem Sie die Elektrode in die Mitte des Sichtfeldes verschieben.
Untersuchen Sie die Elektrode unter Hellfeldbeleuchtung sorgfältig mit der 40X Wassertauchlinse, um sicherzustellen, dass die Elektrode klar und ohne Schmutz oder Blasen erscheint. Wechseln Sie mit einem 488-Nanometer-Laser zur konfokalen Laserscanmikroskopie. Schalten Sie den Stimulator bei 12 Volt ein, um den Farbstoffauswurf zu testen.
Um die Spitze der Elektrode sollte eine große fluoreszierende Farbwolke sichtbar sein. Dann, unter hellem Feld langsam senken Sie die Elektrode in Richtung der Scheibe, anhalten danieren direkt über der Oberfläche. Um eine von Interesse sindde Astrozytenmiton mit Iontophorese zu füllen, verwenden Sie den Infrarot-Differentialinterferenzkontrast, um Astrozyten mit langgestreckter ovaler Somata mit einem Durchmesser von etwa 10 Mikrometern, 40 bis 50 Mikrometer unter der Scheibenoberfläche zu identifizieren.
Dies ist die Stratum-Radiatum des Hippocampus direkt unter der pyramidenförmigen Zellschicht. Während wir uns durch das Gewebe bewegen, können wir Blutgefäße, Neuronen, Astrozyten und andere Zelltypen sehen. Sobald ein Astrozyten ausgewählt wurde, bewegen Sie die Zelle in die Mitte des Sichtfeldes und senken Sie langsam die Elektrodenspitze in die Scheibe, indem Sie durch das Gewebe navigieren, bis sich die Elektrode auf der gleichen Ebene wie der Zellkörper befindet.
Sobald der Zellkörper der Astrozyten deutlich sichtbar und umrissen ist, bringen Sie die Elektrode langsam und sanft vorwärts und bewegt die Elektrode, bis die Spitze das Soma der Zelle aufspießt. Bewegen Sie den Fokus des Objektivs langsam nach oben und unten, um zu beachten, ob sich die Elektrode im Inneren des Soma befindet. Sobald sich die Elektrodenspitze innerhalb der Zelle befindet, schalten Sie den Stimulator bei 0,5 bis 1 Volt ein, um kontinuierlich Strom in die Zelle auszustoßen.
Beobachten Sie mit dem konfokalen Mikroskop den Zellfilm, erhöhen Sie den digitalen Zoom, um die Details der Zelle zu visualisieren und sicherzustellen, dass die Spitze der Elektrode bei Bedarf in der Zelle sichtbar ist. Warten Sie etwa 15 Minuten, bis die feineren Zweige und Prozesse definiert erscheinen, bevor Sie die Spannung ausschalten und die Elektrodenspitze vorsichtig aus der Zelle zurückziehen. Um die gefüllte Zelle abzubilden, warten Sie 15 bis 20 Minuten, bis die Zelle zu ihrer ursprünglichen Form zurückkehrt, bevor Sie die Einstellung am konfokalen Mikroskop anpassen, um sicherzustellen, dass die feineren Zweige und Prozesse unter dem 40X-Objektiv definiert erscheinen.
Richten Sie einen Z-Stack mit einer Schrittgröße von 0,3 Mikrometern ein, bewegen Sie das Objektiv während der Bildgebung, bis kein Signal von der Zelle vorhanden ist, und legen Sie diesen Schritt als Oberseite fest. Bewegen Sie dann das Ziel nach unten, fokussieren Sie sich durch die Zelle, bis kein Signal vorhanden ist, und setzen Sie diesen Schritt als Boden. Überprüfen Sie nach Abschluss der Bildgebung die Elektrode auf Farbstoffauswurf.
Wenn eine große Färbewolke erscheint, kann die Elektrode für die nächste Scheibe verwendet werden. Andernfalls ersetzen Sie die Elektrode. Durch die Erzeugung einer maximalen Intensitätsprojektion kann eine detaillierte Ansicht der Struktur einer Astrozyten in ihrer Domäne beobachtet werden.
Ein Vier-X-Magnituden-Zoom in die Astrozyten zeigt eine maximale Intensitätsprojektion eines Hauptzweigs, mehrerer Sekundärzweige und die Verteilung der umgebenden Verzweigungen und Flugblätter. Hier wird das Originalbild einer CA1-Astrozyten gezeigt. Der Zellkörper, die Hauptzweige, Prozesse und das von der Astrozyten eingeschlossene Gebietsvolumen werden in diesen nachfolgenden Bildern rekonstruiert.
Nach der Erstellung der Rekonstruktionen wurden die Volumina des Soma, der gesamten Zelle und des Territoriums quantifiziert. Und die Zahl der großen Zweige wurde gezählt. Als zytoskelettales Protein, das zwischengeschaltete Astrozytenfilamente kennzeichnet, wird in dem Zellsoma, hauptzweigen und einigen sekundären Astrozytenzweigen exprimiert, aber nicht in den feineren Zweigen und Prozessen.
In dieser repräsentativen Analyse wurden keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der Primärzweige gefunden, die durch glialfibrilläres saures Protein gekennzeichnet sind, und solche, die durch luziferes Gelb visualisiert werden. Darüber hinaus waren die Zellfläche und das Volumen des Astrozyten, das durch glialfibrilläres saures Protein gekennzeichnet ist, deutlich kleiner als die mit Luzifergelb visualisierte Fläche und das Volumen, was zeigt, dass glialfibrilläres saures Protein ein zuverlässiger Marker für die Kennzeichnung wichtiger Zweige ist, aber nicht nützlich ist, um die Gesamtfläche oder das Volumen der Zelle zu bestimmen. Die Menge des von der Elektrodenspitze freigesetzten Farbstoffs hängt von der Elektrodenbeständigkeit ab, die hoch genug sein muss, um einen stetigen Farbstrom ausstoßen zu können.
Zukünftige Studien können die verschiedenen Komponenten der Astrozytenstruktur durch Superauflösung Selightmikroskopie oder durch immunhistochemische Analyse der Expression spezifischer Proteine innerhalb der Astrozytenstruktur untersuchen.
