Zu verstehen, wie sich Astrozyten entwickeln und ihre komplexe Morphologie etablieren, ist wichtig, um zu verstehen, wie sich das Gehirn entwickelt und funktioniert. Dieses Protokoll beschreibt, wie Schlüsselaspekte der Astrozytenmorphologie im Hirngewebe analysiert werden können. Dieses Protokoll verwendet einen benutzerdefinierten Code, um das Volumen des Astrozytenterritoriums in dicken Gewebeabschnitten zu messen.
Diese Strategie kann auch angewendet werden, um die Menge der Gebietsüberlappung zwischen benachbarten Astrozyten zu messen. Durch die Kombination dieses Protokolls mit der genetischen Manipulation von Astrozyten können Forscher die Rolle spezifischer Proteine und Signalwege bei der Astrozytenentwicklung und der Astrozyten-Astrozyten-Interaktion direkt untersuchen Um zunächst eine frische TBST-Lösung vorzubereiten, indem sie 1 Milliliter 10% Triton X in eine 50-Milliliter-Tube geben und die Röhre auf 50 Milliliter mit TBS füllen. Bereiten Sie 2 Milliliter Blockierungs- und Antikörperlösungen für jedes Gehirn vor, indem Sie Ziegenserum und TBST in einem 15-Milliliter-Röhrchen.
Als nächstes beschriften Sie eine 24-Well-Platte, um verschiedene Proben in verschiedenen Zeilen in verschiedenen Lösungen in verschiedenen Spalten zu platzieren, fügen Sie dann einen Milliliter TBST zu den ersten drei Spalten hinzu, die als wash 1, wash 2 und wash 3 gekennzeichnet sind, und fügen Sie 1 Milliliter Blocklösung zur vierten Spalte hinzu. Bereiten Sie einen Glaspickel vor, indem Sie das Ende einer 5,75-Zoll-Pasteur-Pipette mit einem Bunsenbrenner in einen kleinen Haken schmelzen, dann Gewebeabschnitte von der 12-Well-Platte in die Waschspalte 1 der 24-Well-Platte mit dem Pick-Plate übertragen und dann die Abschnitte jeweils 10 Minuten lang in Waschen 1, 2 waschen. und 3 Vertiefungen durch Verwendung des Glaspickels, um die Abschnitte von einem Brunnen zum nächsten zu übertragen, gefolgt von der Inkubation der Abschnitte für eine Stunde in der Blockierlösung. Bereiten Sie q Milliliter primäre Antikörperlösung vor, indem Sie den Antikörper in die Antikörperlösung geben, dann kurz vortexen und zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei mehr als oder gleich 4.000 mal g bei 4 Grad Celsius.
Als nächstes inkubieren Sie die Abschnitte im primären Antikörper für 2 bis 3 Nächte bei 4 Grad Celsius während des Schüttelns. Nach der primären Antikörperinkubation saugen Sie die Day-1-TBST aus den Waschbrunnen ab, fügen dann 1 Milliliter neue TBST zu jeder Waschmulde hinzu und bewegen Sie die Abschnitte in die erste Waschquelle. Als nächstes inkubieren Sie Abschnitte im sekundären Antikörper für 3 Stunden bei Raumtemperatur.
Nach der sekundären Antikörperinkubation saugen Sie die Day-2-TBST aus den Waschbrunnen ab, fügen dann 1 Milliliter neue TBST zu jeder Waschmulde hinzu und bewegen Sie die Abschnitte in die erste Waschquelle. Nehmen Sie während der letzten Wäsche das Trägermedium von 4 Grad Celsius heraus und lassen Sie es auf Raumtemperatur erwärmen, bereiten Sie dann eine 2-zu-1-Mischung aus TBS und deionisiertem Wasser vor und geben Sie es in eine Petrischale. Als nächstes bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie 800 Mikroliter 2-zu-1-Mischung aus TBS und deionisiertem Wasser auf die Oberfläche geben.
Übertragen Sie die Abschnitte aus dem Waschbrunnen 3 in die Petrischale, dann mit einem feinen Pinsel, geben Sie die Abschnitte einzeln von der Petrischale in die Flüssigkeit auf dem Objektträger. Als nächstes ordnen Sie die Abschnitte sorgfältig an, so dass sie mit dem Pinsel flach auf dem Dia liegen. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit aus dem Objektträger mit einer P-1000-Pipette, gefolgt von einer Vakuumabsaugung.
Sobald die gesamte überschüssige Flüssigkeit aus dem Objektträger entfernt wurde, verwenden Sie eine Transferpipette, um sofort 1 Tropfen Montagemedien zu jedem Abschnitt hinzuzufügen, und legen Sie vorsichtig einen Deckzettel über den Objektträger. Lassen Sie das Montagemedium einige Minuten ausbreiten und entfernen Sie dann alle überschüssigen Montagemedien, die unter dem Deckglas durch Vakuumabsaugung herauskommen. Danach verschließen Sie alle vier Kanten des Deckschliffs mit klarem Nagellack.
Lassen Sie die Dias 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie sie dann flach bei 4 Grad Celsius. Lokalisieren Sie mit einem 10-fachen Objektiv einzelne Zellen für die Bildgebung und notieren Sie die spezifische Gehirnregion oder Subregion, die für das Experiment relevant ist, und bestimmen Sie dann mit dem Fokusknopf, ob der gesamte Astrozyt in dem Schnitt enthalten ist. Wechseln Sie anschließend zu einem Ölobjektiv mit höherer Vergrößerung und bringen Sie die Zelle in den Fokus.
Während Sie durch das Okular schauen, verwenden Sie den Fokusknopf, um sich von oben nach unten in der Zelle zu bewegen, und inspizieren Sie dann die Zelle visuell, um sicherzustellen, dass die gesamte Zelle im Abschnitt enthalten ist. Passen Sie mit der mit den konfokalen Mikroskopen verbundenen Erfassungssoftware die Erfassungsparameter an, um ein angemessenes Signal-Rausch-Verhältnis und einen angemessenen Detaillierungsgrad zu erhalten, und verwenden Sie dann den 2-fachen Zoom für ein 40-faches Objektiv und keinen Zoom, wenn Sie ein 60-faches oder ein 63-faches Objektiv verwenden. Stellen Sie die oberen und unteren Grenzen des Z-Stacks mit einer Schrittgröße von 0,5 Mikrometern ein, um sicherzustellen, dass der gesamte Astrozyt mit dem ersten und letzten Bild ohne fluoreszierende Markierung der Zelle erfasst wird.
Bevor Sie mit der Analyse beginnen, installieren Sie die konvexe Rumpferweiterungsdatei XtspotsConvexHull, indem Sie die Datei in den rtmatlab-Unterordner des XT-Ordners einfügen. Konvertieren Sie mit dem Imaris File Converter Bilder in das IMS-Format. Öffnen Sie als Nächstes eine Bilddatei in der Bildanalysesoftware und wählen Sie die Schaltfläche 3D-Ansicht, um das Bild im 3D-Modus anzuzeigen und sicherzustellen, dass die Zelle die Einschlusskriterien erfüllt.
Um eine Fläche zu erstellen, klicken Sie auf das blaue Symbol Neue Flächen hinzufügen, und erstellen Sie dann einen Bereich von Interesse um die Zelle, indem Sie Bemaßungen in die Felder unter Größe des Flächenerstellungswerkzeugs eingeben oder die Kanten des gelben Felds ziehen. Passen Sie als Nächstes die absolute Schwellenwertintensität an, indem Sie den gelben Balken ziehen oder Werte in das Feld eingeben, sodass die graue Oberfläche so viel wie möglich vom Zellsignal ausfüllt, ohne die Grenze der Zelle zu überschreiten. Klicken Sie anschließend auf den grünen Pfeil, um die Generierung der Oberfläche abzuschließen.
Überprüfen Sie die neu generierte Oberfläche sorgfältig und löschen Sie alle Oberflächenteile, die nicht Teil der Zelle sind, indem Sie sie auswählen und dann auf das Werkzeug Bleistiftbearbeitung und anschließend auf die Option Löschen klicken. Um die verbleibenden Oberflächenteile zu vereinheitlichen, klicken Sie auf das Symbol Trichterfilter, um alle auszuwählen, klicken Sie dann auf das Symbol Bleistiftbearbeitung und wählen Sie die Option Unify. Klicken Sie auf das orangefarbene Symbol Neue Spots hinzufügen und wählen Sie den richtigen Quellkanal aus der Dropdown-Liste aus, und geben Sie dann einen geschätzten XY-Durchmesserwert von 0,400 Mikrometern in das Feld ein.
Klicken Sie anschließend auf den grünen Pfeil, um die Erstellung der Spots abzuschließen, und wählen Sie die Spots dann erneut aus. Klicken Sie auf das Symbol Filter, und wählen Sie in der Dropdown-Liste die Option Kürzeste Entfernung zu Flächen Flächen X aus, wobei Flächen X die zu analysierende Fläche ist, um sicherzustellen, dass sowohl der untere als auch der obere Schwellenwert grün sind. Geben Sie als Nächstes einen Mindestabstand von minus 1,0 Mikrometer in das untere Schwellenwertfeld und einen maximalen Abstand von 0,1 Mikrometern in das obere Schwellenwertfeld ein und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Abschnitt zu neuen Spots duplizieren, um sicherzustellen, dass die neu erstellten Spots im oberen linken Bereich des Softwarefensters ausgewählt werden.
Klicken Sie anschließend auf das Gear Tools-Symbol und dann nur einmal auf das Convex Hull-Plugin und warten Sie, bis das MATLAB-Fenster angezeigt wird und dann verschwindet, was zu einem soliden Rumpf in der 3D-Ansicht führt. Stellen Sie im oberen linken Bereich sicher, dass Konvexer Rumpf von Spots X Auswahl, Kürzeste Entfernung, wobei Spots X Auswahl die neu erstellten Spots ist, ausgewählt ist, und klicken Sie dann auf den Rumpf, um ihn auszuwählen. Klicken Sie anschließend auf das Symbol Graph Statistics.
Stellen Sie auf der Registerkarte Auswahl sicher, dass Bestimmte Werte aus der oberen Dropdown-Liste ausgewählt ist, und wählen Sie dann Volumen aus der unteren Dropdown-Liste aus, zeichnen Sie dann das Volumen des Rumpfes auf und speichern Sie die Datei, um mit dem nächsten Bild fortzufahren. Das Volumen des Astrozytenterritoriums wurde in Astrozyten gemessen, die ein membrangerichtetes rotfluoreszierendes Protein exprimieren. Der Knockdown des mit Astrozyten angereicherten Zelladhäsionsmoleküls hepaCAM reduziert das Volumen des Astrozytenterritoriums signifikant.
Die Mosaikanalyse mit Doppelmarkern wurde verwendet, um Mäuse zu erzeugen, bei denen Wildtyp-Astrozyten ein rot fluoreszierendes Protein und HepaCam-Knockout-Astrozyten ein grün fluoreszierendes Protein exprimieren. Der Prozentsatz der Gebietsüberlappung zwischen benachbarten rot- und grün fluoreszierenden Proteinastrozytenpaaren wurde berechnet. Die Mäuse mit genetischer Modifikation von hepaCAM und grünen Astrozyten zeigten einen signifikant erhöhten Prozentsatz des Gebietsüberlappungsvolumens mit ihren roten Wildtypnachbarn im Vergleich zu reinen Wildtyp-Astrozytenpaaren.
Dieses Ergebnis zeigt, dass hepaCAM für normales Astrozytengebietsvolumen und Astrozytenkachelung erforderlich ist. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zelle die Einschlusskriterien erfüllt. Eine unvollständige Zelle hat ein kleineres Gebietsvolumen und kann Ihre Gesamtergebnisse und Schlussfolgerungen beeinflussen.
