Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Nephrologie über die Rolle des Zelloberflächenproteinhandels bei Proteinurnen und nicht bei proteinurc Nierenerkrankungen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie die Untersuchung des Zelloberflächen-Proteinhandels in-vivo erleichtert und dass mehr als ein Protein pro Experiment analysiert werden kann. Obwohl diese Methode Einen Einblick in den handel mit glomerulären Zelloberflächen bieten kann, kann sie auch auf andere Organsysteme angewendet werden, die durchsetzt sind und durch Isolationstechniken zugänglich sind.
Beginnen Sie mit der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen und desinfizieren die ventrale Seite der anästhesierten Maus mit 70%isopropyl. Machen Sie einen Median schnitt durch die Haut vom Becken bis zum Brustbein und verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut von der Bauchfaszie zu entfernen. Schneiden Sie die Haut auf beiden Seiten der Bauchmittellinie und machen Sie ein Medium durch die Bauchmuskelschicht von der Blase bis zum Xiphoid.
Verwenden Sie die Schere und Zange, um die Muskeln in vier Quadranten zu teilen Und verwenden Sie zwei chirurgische Klemmen, um die oberen beiden Quadranten in Richtung des Halses der Tiere zu sichern. Legen Sie das Tier unter ein Sezieren des Mikroskops und verwenden Sie einen sterilen Swap, um die viszeralen Organe beiseite zu bewegen. Schneiden Sie mit einer feinen Schere das hepatische Phrenische Band.
Mit feiner chirurgischer Pinzette, legen Sie eine Naht um die hepatische mesenterische Arterie kleial der Nierenarterien. Und um die Aorta, proximal zu den Nierenarterien, an der Nebenniere. Befreien Sie die distale Aorta von der Faszien, Fett und anderem Gewebe.
Dann klemmen Sie die Vena cava und die Aorta auf der Höhe der Bifurkation und legen Sie eine weitere Naht um die Aorta distal der Nierenarterien. Verwenden Sie eine Pinzette, um die proximale Aortennaht zu straffen, den Blutfluss zu dämpfen und ein kleines Loch die Hälfte des Durchmessers der Aorta in die Aorta zu schneiden, distal zu den Nierenarterien. Legen Sie einen 10-Zentimeter-Katheter, der an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, die fünf Milliliter eiskalte SEiskalteS PBS plus Kalzium und Magnesium enthält, in die Aorta ein.
Und fixieren Sie den Katheter mit den vorbereiteten Ligaturen. Dann beginnen Sie, die Nieren mit einem Durchfluss von zwei Millilitern pro Minute zu durchdringen. Mit einer feinen Schere, um ein Loch in die Nierenvene an den Nierenarterien zu schneiden und die Naht um die Leber- und Mesenterarterien zu straffen.
Nach der Lieferung des gesamten PBS-Volumens ersetzen Sie die Perfusate durch fünf Milliliter eiskalte Seiskaltes PBS plus Kalzium und Magnesium, ergänzt mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Biotin zur Oberflächenkennzeichnung. Fahren Sie fort, die Nieren mit einem Durchfluss von zwei Millilitern pro Minute zu durchdringen. Wenn das gesamte Volumen geliefert wurde, befestigen Sie eine Spritze mit fünf Millilitern eiskaltem PBS plus Kalzium und Magnesium, ergänzt mit 100 Millimolarglycin, an den Katheter.
Die Glomeruli mit allen fünf Millilitern der Glycinlösung bei einem Durchfluss von zwei Millilitern pro Minute ablöschen. Dann durchdringen Sie die Nieren mit fünf Millilitereisis PBS plus Kalzium und Magnesium, ergänzt mit 200 Mikrolitermagnetperlen pro Milliliter bei einem Durchfluss von zwei Millilitern pro Minute. Die Embolie der Glomeruli mit den braunen Magnetperlen wird auf der Nierenoberfläche sichtbar sein.
Wenn alle Perlen geliefert wurden, entfernen Sie die Kapsel der Nieren und ernten Sie die Nieren am Hilum. Legen Sie die Nieren in eine 10-Zentimeter-Zellkulturschale mit 15 Milliliter PBS plus Kalzium und Magnesium. Verwenden Sie eine neue doppelschneidende Klinge, um die Nieren in die kleinsten Stücke zu schneiden.
Übertragen Sie das Gewebe in ein Zwei-Milliliter-Rohr mit einem Milliliter Kollagenase A für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, mischen Sie die Gewebelösung sanft vor und nach der Verdauung mit einer modifizierten 1000 Mikroliter Pipettenspitze. Filtern Sie am Ende der Inkubation das verdaute Gewebe durch ein 100-Mikron-Zellsieb. Verwenden Sie einen Zellschaber und eiskalte PBS plus Kalzium und Magnesium, um das restliche Gewebe durch das Zellsieb zu zermahlen.
Bringen Sie das Endvolumen der Niereneinzelzellsuspension bis zu 50 Milliliter mit frischer eiskalter PBS plus Kalzium und Magnesium und sammeln Sie die Nierenzellen durch Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit etwas weniger als 1,5 Millilitereis pbS plus Kalzium und Magnesium während des Wirbelns wieder auf und übertragen Sie die glomeruläre Suspension in ein neues Zwei-Milliliter-Rohr. Um die Glomeruli zu waschen, legen Sie die Röhre in einen Magneten, um die Glomeruli zu aggregieren.
Nach einer Minute verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um den Überstand zu entfernen. Und entfernen Sie das Rohr vom Magneten. Fügen Sie dem Gewebe einen Milliliter PBS plus Kalzium und Magnesium hinzu.
Pipette die Glomeruli auf und ab einmal und Wirbel die Zellen. Das Rohr zum Magneten zurückgeben und die Glomeruli wieder waschen, wie gerade gezeigt. Bis eine Probenreinheit durch Lichtmikroskopanalyse bei einer Vergrößerung von 40 bis 100 X mindestens 90% erreicht hat.
Dann sammeln Sie die magnetische Perle gereinigt glomeruli durch Zentrifugation. Um eine Reinheit von mehr als 95 % zu erreichen, mussten die Glomeruli gründlich gewaschen werden, wie gezeigt. Biotinperfusion erleichtert die Kennzeichnung der Kapillarschlaufen in Biotin, aber nicht kontrolliertperfundiertemausiperierten Mausnieren.
Die Immunfällung der Biotinfraktion glomerulärer Extrakte zeigt, dass die glomerulären Transmembranproteine Nephrin und Podocalyxin mit dem Biotin immunpräzipiert werden, jedoch nicht mit der Kontrollfraktion. Die Färbung der immunpräzipitierten Fraktion mit Streptavidin bestätigt ferner das Vorhandensein von Biotin-laded Nephrin in den biotin durchgesätzten, aber nicht kontrollierten perfundierten Tieren. Endotheliale Protein vaskuläre endotheliale Cadherin und intrazelluläre Adhäsion Molekül zwei sind auch innerhalb der Biotinfraktion immunpräzipiert.
In der frühen Phase der nephrotoxischen Nephritis wird bei nephrotoxischen Nephritistieren im Vergleich zu Kontrollen eine reduzierte Expression von Zelloberfläche Nephrin beobachtet. Tatsächlich zeigt die densitometische Analyse eine signifikante Reduktion von Biotin laded Nephrin bei nephrotoxischen Nephritistieren im Vergleich zu Controllern. Quantitative Analysen des Gesamt-Nephrin-Zu-Aktivin-Verhältnisses zeigen keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrolle und nephrotoxischen Nephritis-Mäusen.
Darüber hinaus werden bei nephrotoxischer Nephritis und Kontrolltieren gleiche Mengen an Podozyten beobachtet. Bei der späten nephrotoxischen Nephritis zeigen nephrotoxische nephritische Tiere eine Wiederherstellung der Nephrinexpression ohne signifikante Unterschiede in der Zelloberfläche Nephrin, gemessen zwischen Kontroll- und nephrotoxischen nephritischen Mäusen, und einer gesamten Nephrinreduktion bei nephrotoxischen nephritischen Tieren. Darüber hinaus werden podocyte Zahlen im Vergleich zu Kontrolltieren verringert.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Spritzen blase frei während ihrer Verbindung zu halten, um Luftembolie der Glomeruli zu vermeiden und unter eiskalten Bedingungen zu arbeiten, sobald die Nierenperfusion begonnen hat. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Isolierung von Glomeruli RNA und Protein durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die Proteinexpression oder Wechselwirkungen in gesunden und kranken Nieren zu beantworten.
