Immortalisierte glomeruläre Endothelzellen mit stabilen fluoreszierenden Mitochondrien sind ein großartiges Werkzeug, um die Wirkung verschiedener Reize auf die mitochondriale Struktur in vitro zu untersuchen. Die im vorliegenden Artikel beschriebene Methode liefert eine hohe Anzahl von glomerulären Endothelzellen. Durch das Testen kleiner Moleküle auf einem GEC könnten wir nach einer Monotherapie für diabetische Nierenerkrankungen suchen, bei denen die GECs betroffen sind.
Die beschriebene Methode ist einfach durchzuführen und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Es ist jedoch wichtig, die beschriebenen Schritte zu befolgen und die Ausrüstung zu sterilisieren, um eine Kontamination zu vermeiden. Um zu beginnen, legen Sie die Perfusions- und Isolierungsmaterialien, die erforderlich sind, um nierenglomeruläre Zellen zu isolieren, auf einen Arbeitsbereich.
Filtern Sie die frisch zubereitete Hanks'Balanced Salt Solution (HBSS) mit einem 0,2-Mikron-Filter und bewahren Sie sie unter der Haube auf, um eine Kontamination zu vermeiden. Mischen Sie dann 200 Mikroliter Magnetperlen mit 20 Milliliter HBSS. Wärmen Sie das RPMI mit 10% FCS und Endothelzellkulturmedium im Wasserbad bei 37 Grad Celsius vor.
Dann beschichten Sie zwei Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit zwei Milliliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter Kollagen IV für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Platte zweimal mit PBS, um die Essigsäure zu entfernen, die zur Verdünnung des Kollagens verwendet wird. Verwenden Sie die beschichteten Platten sofort oder lagern Sie sie bis zu vier Wochen bei zwei bis acht Grad Celsius.
Reinigen Sie die chirurgischen Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Anschließend autoklavieren Sie die chirurgischen Instrumente für 30 Minuten. Nachdem Sie den Bauch einer anästhesierten Maus geöffnet haben, führen Sie eine Schmetterlingsnadel in den linken Ventrikel ein.
Um 100 Mikroliter der Perlenlösung zu injizieren, um die Durchblutung zu erweitern, brechen Sie vorsichtig die untere Hohlvene unterhalb der Nieren mit einer 19-Gauge-Nadel und setzen Sie die Perfusion der Perlenlösung fort. Als nächstes entfernen Sie vorsichtig das Fettgewebe mit einer Pinzette, schneiden beide Nieren mit einer dünnen chirurgischen Schere C heraus und legen Sie sie auf einen Teller mit einem Milliliter HBSS auf Eis. Zerkleinern Sie die Niere mit einem sterilen Skalpell in einen Millimeter kleine Stücke.
Inkubieren Sie die gehackte Niere mit einem Millimeter frisch zubereiteter Kollagenase Typ II für 35 Minuten bei 37 Grad Celsius mit leichtem Kippen auf einem horizontalen Shaker. Nach der Verdauung fügen Sie vier Milliliter RPMI mit 10% FBS hinzu, um die Kollagenase zu neutralisieren. Filtern Sie das verdaute Gewebe durch ein steriles 100-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen.
Verwenden Sie den Boden eines sterilen 1,5-Milliliter-Röhrchens, um das verdaute Gewebe gegen das Sieb zu rühren, damit die Glomeruli durchgehen können. Spülen Sie das Zellsieb mit 15 Milliliter HBSS ab. Dann zentrifugieren Sie den Durchfluss bei 200 XG für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
In diesem Stadium enthält die Röhre drei Schichten. Die obere Schicht enthält kleinere Strukturen wie Tubuli, die mittlere Schicht besteht aus Perlen mit Glomeruli und die untere Schicht enthält Trümmer. Den Überstand und die oberste weiße Schicht vorsichtig absaugen.
Dann resuspendieren Sie das Pellet mit den Perlen mit den Glomeruli und Ablagerungen in 1,5 Milliliter HBSS und geben Sie es in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen in einen magnetischen Konzentrator und saugen Sie den Überstand ab, bevor Sie die Perlen zweimal mit einem Milliliter HBSS waschen. 20 Mikroliter Zellsuspension auf einen Objektträger geben.
Beobachten Sie dann den Objektträger unter einem Mikroskop auf Glomerulis Anwesenheit. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet in einem Endothelzellwachstumsmedium und übertragen die Suspension in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie einen Mikroliter Interferon-Gamma für jeweils drei Milliliter Medium hinzu und legen Sie die Zellen zur Inkubation bei 33 Grad Celsius in eine Platte mit sechs Vertiefungen.
Nach drei Tagen Kultur das Milliliter-Medium vorsichtig durch ein frisches Medium ersetzen. In diesem Stadium sind die Zellen heterogen mit einer Mischung von glomerulären Zellen. Ersetzen Sie das Medium nach sieben Tagen durch zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium für Endothelzellen, ergänzt mit Interferon gamma, um die Zellproliferation zu starten.
Nach 10 Tagen, wenn die Zellen 80% erreichenKonfluenz, passieren Sie sie mit Trypsin und geben Sie sie in einen T-25-Kolben, der mit Kollagen IV beschichtet ist.Nach 21 Tagen Kultur werden die Zellen in einen T-75-Kolben überführt. Drei Milliliter 0,25% Trypsin in einen T-75-Kolben geben und die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dann neutralisieren Sie das Trypsin mit drei Milliliter endothelialem Wachstumsmedium und überführen die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation bei 200 XG für fünf Minuten.
Saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie die Zellen in einem Milliliter PBS, das 1% BSA, zwei Millimolar EDTA, 1% Penicillin / Streptomycin enthält. Zentrifugieren und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern CD31-Antikörper-beschichteten Beads und 800 Mikrolitern PBS. Inkubieren Sie die Zellen für 45 Minuten mit kontinuierlichem Schütteln bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Als nächstes legen Sie das Röhrchen in den magnetischen Konzentrator und waschen Sie die Zellen viermal mit PBS, das BSA, EDTA und Penicillin / Streptomycin enthält. Nach dem letzten Waschgang resuspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter endothelialem Wachstumsmedium, ergänzt mit Interferon gamma. Platte 1,5 Milliliter Zellen pro Vertiefung in Kollagen IV beschichteten Vertiefungen auf einer Sechs-Well-Platte und Kultur unter permissiven Bedingungen bei 33 Grad Celsius.
Ersetzen Sie nach vier Tagen 750 Mikroliter des Mediums durch ein frisches endotheliales Wachstumsmedium, ergänzt mit Interferon gamma. Nach 10 bis 14 Tagen Kultur beobachten Sie mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem 488-Nanometer-Filter CD31-positive glomeruläre Endothelzellen oder GECs, Kolonien, die fluoreszierende Mitochondrien exprimieren. Nach 21 Tagen oder wenn die Zellen 80 bis 90% Konfluenz erreicht haben, werden sie in einen T-25-Kolben überführt.
Pflegen Sie die Kultur mit einem RPMI-Wachstumsmedium, das 10% FCS enthält. Alternativ können Zellen kryokonserviert werden. Passage Zellen mit Trypsin, wie zuvor gezeigt.
Dann zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter Gefriermedium. Aliquot die Zellen in Kryoröhren und speichern Sie sie in flüssigem Stickstoff, Dampftemperatur. Dieses Protokoll beschrieb eine Methode zur Isolierung von glomerulären Endothelzellen.
Aus den isolierten Glomeruli begannen die Zellen nach drei Tagen Kultur langsam zu wachsen. Nach sieben Tagen erschienen die Zellen heterogen und zeigten andere glomeruläre Zelltypen wie Podozyten, parietale, epitheliale und mesangiale Zellen. Nach Erreichen einer Konfluenz von 70 bis 80% wurden andere glomeruläre Zellen unter Verwendung einer positiven Selektion von Endothelzellen entfernt.
Die MitoDendra2 GECs exprimierten CD31 und waren negativ für Podozytenmarker, wie durch Synaptopodin-negative Färbung gezeigt. Die Wirkung der Glukosekonzentration auf die Mitochondrienstruktur wurde untersucht. Im Vergleich zu den länglichen Mitochondrien, die in Zellen unter normaler Glukose sichtbar sind, induzierte eine hohe Glukose die Fragmentierung oder Spaltung von Mitochondrien, wie sie von prominenten sphäroidförmigen Mitochondrien beobachtet wurde.
Darüber hinaus wurde ein 405-Nanometer-Laser verwendet, um eine ausgewählte Subpopulation von Mitochondrien in ein einzelnes lebendes MitoDendra2 GEC zu photokonvertieren. Ein erfolgreicher Photoswitching der Mitochondrien von grün nach rot im ausgewählten Bereich für normal und mit hoher Glukosekonzentration behandelte Zellen wird gezeigt. Diese Umschaltung ermöglichte es, die Fusionsereignisse in MitoDendra2-GECs zu beobachten.
Unter normaler Glukose wurden gelb verschmolzene grüne und rote Fluoreszenz aufgrund der Mitochondrienmatrixfusion beobachtet. Im Gegensatz dazu waren in den mit hoher Glukose behandelten GECs die Mitochondrien hauptsächlich fragmentiert. Das Platzieren der Zellen in einer Vertiefung mit sechs Vertiefungen mit einem kleinen Volumen an Wachstumsmedium ist unerlässlich, damit sich die Zellen an der Schale festsetzen können.
Die isolierten Endothelzellen könnten verwendet werden, um mitochondriale Funktions- und Strukturstudien durchzuführen. Die Verwendung von immortalisierten Endothelzellen mit fluoreszierenden Mitochondrienmerkmalen wird den Weg zur Wirkstoffforschung ebnen. Die kleinen Moleküle könnten an den Zellen getestet werden, und Live-Bildgebung wird durchgeführt, um ihre Wirkung auf die Funktion der Mitochondrien zu untersuchen.
