Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der humanen Keimbahntoxikologie zu beantworten, wie z. B. wie Schäden im Genom menschlicher Urkeimzellen entstehen oder repariert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass menschliche Urkeimzellen in zwei Wochen aus den grundierten pluripotenti-iPS-Zellen mit Krankheitsveranlagung genetischen Hintergrund erzeugt werden können. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Prävention genomischer Beeinträchtigungen in menschlichen Keimbahnzellen, da unser Zellkulturmodell uns helfen kann, die Keimbahntoxizität eines therapeutischen Medikaments zu reduzieren.
Um mit der Erzeugung von menschlichen urwüchsigen Keimzell-ähnlichen Zellen oder menschlichen PGCLCs zu beginnen, bereiten Sie extrazelluläre Matrixprotein-beschichtete Platten und Zellsuspension menschlicher iPSCs vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie eine einzellige Suspension der grundierten Pluripotenz humaner iPSCs im mTeSR1-Medium vor, das den Y-27632 Rho-Kinase-Inhibitor enthält. Passen Sie die Zelldichte vorsichtig auf 100.000 Zellen pro Milliliter an.
Impfen Sie zwei Milliliter Zellsuspension von grundierten menschlichen iPSCs in jedem Brunnen der extrazellulären Matrix-Protein-beschichteten Sechs-Well-Platten, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt werden, indem die Platten vertikal und horizontal geschüttelt werden. Inkubieren Sie die Platten in einem Tri-Gas-CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Es ist sehr wichtig, genau 200.000 Zellen in jedem Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte zu impfen.
Eine genaue Zählung der Zellen ist entscheidend. Nach Abschluss der transienten Umwandlung in naive Pluripotenz sollten Zellen über-konfluent aussehen, was normal ist. Der genaue Zeitpunkt des mittleren Wandels ist wichtig, um hohe menschliche PGCLCs und experimentelle Reproduzierbarkeit zu erreichen.
Die Dichte der 4i hiPSC-Kultur ist unter diesen Bedingungen hoch, und es wird erwartet, dass die Zelle bei 48 bis 72 Stunden nach der Impfung konfluent wird. 24 Stunden nach der Impfung das Medium mit zwei Millilitern pro Bohrgut mTeSR1-Medium ohne Y27632 ändern. Beginnen Sie die Umwandlung des grundierten Pluripotenzzustands humaniPSCs in 4i naive pluripotente Stammzellen, indem Sie 50 Milliliter 4i komplettes Medium in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 15 Minuten erwärmen.
Nach 48 und 72 Stunden nach der Impfung die Platten aus dem Inkubator entfernen und das Medium mit 2 Millilitern pro Brunnen von 4i komplettem Medium verändern. Zentrifugieren Sie die waschmittelbeschichtete Mikrowellplatte bei 1.000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Prüfen Sie die Brunnen mit einem invertierten Mikroskop, um das Fehlen von Luftblasen zu gewährleisten.
Spülen Sie die Brunnen, wie im Textprotokoll beschrieben, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Fügen Sie 4i komplettes Medium zu den spülten Brunnen hinzu. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, und inspizieren Sie die Brunnen erneut.
Um 4i humane iPSCs in die Mikrowellplatte zu impfen, bereiten Sie die menschliche iPSC-Zellsuspension vor, wie im Protokoll beschrieben. Filtern Sie diese Zellsuspension durch ein 40 Mikrometer Poren-Zellsieb, um Zellaggregate zu entfernen. Waschen Sie das Sieb mit einem Milliliter vorgewärmten 4i komplette Medium dreimal, um alle Zellen aus dem Sieb zu sammeln, und zählen Sie die Zellen mit einem Kulturzähler.
Verdünnen Sie dann diese einzelzellige Suspension von 4i naiven humanen iPSCs auf 27 bis 32,4 Millionen Zellen in 9 Millilitervorwärmten 4i komplettem Medium, das Y27632 enthält. Entfernen Sie zuvor vorbereitete Mikrowell-Platte mit 1 Milliliter 4i komplettem Medium pro Brunnen aus einem Tri-Gas-Inkubator. Impfen Sie 1 Milliliter 4i naive humane iPSC Suspension in jeden Brunnen, um eine Konzentration von 3,0 bis 3,6 Millionen Zellen pro Brunnen zu erreichen.
Sanfte Pipette, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 100 g für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Legen Sie die Platte in einen Tri-Gas-CO2-Inkubator, um sicherzustellen, dass Zellen, die in Mikrobrunnen pellet, nicht stören, und inkubieren Sie für 24 bis 30 Stunden, weil eine nächtliche Inkubation nicht ausreicht, um enge embryonale Körper oder EBs zu bilden.
Vorwarme 5 Milliliter menschliches PGCLC Basalmedium und 20 Milliliter menschliches PGCLC-Gesamtmedium für mindestens fünf Minuten in einem 37 Grad Celsius Wasserbad Vorsichtig legen Sie ein 40 Mikrometer Poren großes Zellsieb auf den Kopf über ein 50 Milliliter Polypropylen Konusrohr. Um EBs von Mikrobrunnen zu lösen, pipette jeden Brunnen der Platte sanft. Um Zellen zu entfernen, die nicht in EBs integriert sind, filtern Sie den Inhalt aller Brunnen durch das Zellsieb.
Waschen Sie die auf der Membran des Zellsiebs zurückgehaltenen EBs vorsichtig mit 1 Milliliter vorgewärmten menschlichen PGCLC-Basalmediums und wiederholen Sie die Wäsche fünfmal. Legen Sie ein frisches 50 Milliliter konisches Rohr auf das Zellsieb, so dass das Zellsieb nun rechts oben im neuen Rohr positioniert ist. Umkehren Sie das Zellsieb schnell mit dem neuen Röhrchen, das die EBs unterhalb der Membran des Zellsiebs positioniert.
Fügen Sie 18 Milliliter vorgewärmtes menschliches PGCLC-Gesamtmedium zur Membran des Zellsiebs hinzu, um EBs in der konischen Röhre zu sammeln. Dann Platte 3 Milliliter pro Brunnen der Suspension von EBs in Brunnen einer niedrigen Befestigung Sechs-Well-Platte. Legen Sie die Platte auf eine Wippe-Move-Rocker in einem Tri-Gas-Inkubator, und stellen Sie vorsichtig die Schaukelgeschwindigkeit auf etwa 20 Umdrehungen pro Minute.
Am tag7. bis 13. des Experiments, frisch vorbereiten 20 Milliliter menschlichen PGCLC komplette Medium jeden Tag. Entfernen Sie die Platte von der Wippe, wodurch die EBs auf den Boden der Brunnen sinken. Entfernen Sie das alte Medium, ohne EBs zu trocknen, so dass in jedem Brunnen etwa 0,2 Milliliter altes Medium verbleiben.
Fügen Sie 3 Milliliter pro Brunnen von frischem menschlichen PGCLC komplette Medium, nach dem Entfernen der alten Medium jeden Tag. Um menschliche PGCLCs als OCT4-positive Zellen zu identifizieren, ernten Sie die EBs in einem 1,5 Milliliter niedrig bindenden Mikrozentrifugenrohr. Lassen Sie die EBs bei Raumtemperatur auf den Boden sinken und entsorgen Sie das Medium.
Spülen Sie die EBs mit eiskalten 1X PBS. Nach dem Entfernen der PBS, inkubieren Sie die EBs in 1 Milliliter eiskalte 1%Gewicht durch Volumen Natriumazid in PBS auf Eis für fünf Minuten. Lassen Sie die EBs bei Raumtemperatur auf den Boden sinken.
Nach dem Wegwerfen des Überstandes die EBs mit eiskaltem PBS abspülen. 200 Mikroliter extrazelluläres Matrixprotein auf Eis auftauen. Fügen Sie das Protein in die Tube mit EBs.
Lassen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für ca. 10 Minuten, bis das Gel erstarrt ist und die EBs eingebettet sind. Um die EBs zu fixieren, fügen Sie 1 Milliliter 4%Formaldehyd in PBS in das Rohr, und inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten mit sanftem Schaukeln. Danach das Formaldehyd entsorgen und die EBs einmal mit eiskaltem PBS abspülen.
1 Milliliter 70% Ethanol hinzufügen. 70% Ethanol bei 4 Grad Celsius bis zu einer Woche aufbewahren oder mit einem Standard-FFPE-Protokoll verarbeiten. Die Zelldichte und die gleichmäßige Verteilung der Zellen auf jedem Brunnen sind entscheidend.
Humane IPSCs in 2 Millilitery Y27632 ergänzen das Medium pro Bohrgut einer Sechs-Brunnen-Platte, erreichen 20 bis 30% Konfluenz nach 24 Stunden. Nach einer zusätzlichen 24-Stunden-Kultur im mTeSR1-Medium, in Abwesenheit von Y27632, Zellen aggregiert und gebildet Kolonien, die etwa 30% der Wachstumsfläche. Nach 24 Stunden Kultur im 4i-Reprogrammierungsmedium erreichten die Zellen die Konfluenz.
Nach weiteren 24 Stunden Kultur im 4i-Medium wurden die Zellen dichter gepackt. Nach einer 24-stündigen Inkubation in Mikrobrunnen im 4i-Reprogrammierungsmedium bildeten Zellen EBs mit ihrer kreisförmigen Kontur, die 24 bis 30 Stunden nach der Impfung sichtbar war. EBs, die im menschlichen PGCLC-Medium unter schaukelnden, nicht haftenden Bedingungen aufbewahrt werden, behielten ihre kugelförmige Form ohne Aggregation nach 24 Stunden bei.
Nach 192 Stunden waren die EBs größer und behielten die gleiche Morphologie bei. Nach 5 Tagen entstanden die Zellen als OCT4-exättige Zellen auf der Oberfläche von EBs, wodurch ihre Anzahl nach 8 Tagen erhöht wurde. Zellen aus der einzelzelligen Suspension menschlicher PGCLCs wurden durch FACS als CD38-positive Zellen angereichert.
Zellen, die CD38 nicht ausdrücken, waren negative Kontrolle. Um eine Kontamination zu vermeiden, wurden DIE FACS-Gates CD38-positive und CD38-negative Zellen mit großem Abstand getrennt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, genaue Zellzählung und Timings der mittleren Veränderung zu folgen.
Das Weglassen mittlerer Veränderungen auch nur einen einzigen Tag, oder die Verringerung des Volumens dieses Mediums in jedem Schritt, kann massiven Zelltod verursachen. Die Geschwindigkeit der Schaukelkultur von embryoiden Körpern muss sorgfältig optimiert werden.
