Diese Methode kann dazu beitragen, große Mengen an rekombinanten RNAs zu produzieren, die für die Anwendung in der Forschung oder in der Industrie von Interesse sind. Der Hauptvorteil ist, dass rekombinante RNA in Escherichia coli in einem billigen Verfahren produziert wird, das leicht skaliert werden kann. Wichtig ist, dass die RNA auf einem kreisförmigen RNA-Gerüst produziert wird, was die Reinigung zur Homogenität erleichtert.
Im Gegensatz zu DNA oder Proteinen werden RNAs von Interesse nicht leicht in großen Mengen in biofaktorischen Systemen, einer solchen Escherichia coli-Kultur, produziert. Unsere Methode basiert auf der Koexpression der RNA von Interesse, die in ein hochstabiles kreisförmiges Gerüst eingefügt wird, und auf einer Ligase, die die RNA-Zirkularisierung vermittelt. Das kreisförmige RNA-Gerüst leitet sich von einem patentierten Viroid ab.
Viroide sind relativ kleine, nicht-spulende, hochgradig basisgepaarte kreisförmige RNAs, die für einige höhere Pflanzen infektiös sind. Wir können dutzende Milligramm der rekombinanten RNA pro Liter Bakterienkultur unter normalen Laborbedingungen produzieren. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, verstärken Sie die cDNA nach PCR, wie im Textprotokoll beschrieben.
Als nächstes fügen Sie 100 Nanogramm des Plasmids pLELVd-BZB zu einem 0,5 Milliliter-Röhrchen hinzu. Fügen Sie 10 U des Typs IIS-Restriktionsenzyms BpiI und genügend Puffer G hinzu, um eine 20-Mikroliter-Reaktion zu erzeugen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um das Plasmid zu verdauen.
Danach trennen Sie die PCR- und Verdauungsprodukte durch Elektrophorese in einem ein prozentigen Agarose-Gel im TAE-Puffer. Färben Sie das Gel, indem Sie es in 200 Milliliter Ethidiumbromid in einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter schütteln. Visualisieren Sie die DNA mit einem UV-Transilluminator.
Verwenden Sie ein Skalpell, um die Bänder auszuschneiden, die der verstärkten cDNA und dem BpiI-verdauten Plasmid entsprechen. Mit Kieselgelsäulen die DNAs aus den Gelfragmenten zu löschen. Quantifizieren Sie die Konzentration der DNA durch spektrophotometrische Analyse.
Richten Sie eine Gibson Assembly-Reaktion mit der verstärkten cDNA und dem verdauten Plasmid ein. Eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius brüten. Verwenden Sie dann eine Kieselgelsäule, um die Reaktion zu reinigen.
Nach der Elektroporating kompetente E.coli DH5-Alpha-Zellen, pflücken Sie mehrere weiße Kolonien und übertragen Sie sie auf flüssiges LB Medium. Wachsen Sie die Kolonien über Nacht bei 37 Grad Celsius. Als Nächstes verwenden Sie ein Miniprep-Kit, um die Plasmide zu reinigen und ihre Größen durch Elektrophorese in einem ein Prozent Agarose-Gel im TAE-Puffer zu analysieren.
Zunächst ko-elektroporate den ausgewählten E.coli-Stamm sowohl mit dem pLELVd-BZB-Derivat, das die cDNA enthält, die der RNA von Interesse entspricht, als auch dem Plasmid P15LTRNISM, um die Auberginen-tRNA-Ligase mitzuexprimieren. Übertragen Sie SOC flüssiges Medium in die Elektroporationsküvette, um die Zellen zurückzugewinnen, und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Dann, Platte die Bakterien auf LB festes Medium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin, und 34 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol.
Inkubieren Bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag 250 Milliliter flüssiges TB-Medium mit 50 Mikrogramm Pro Milliliter Ampicillin und 34 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol zu einem einen Liter verwirrten Erlenmeyerkolben hinzufügen. Holen Sie sich die inkubierte E.Coli, und wählen Sie dann eine Kolonie und impfen Sie das Medium in den Kolben.
Bei 37 Grad Celsius mit kräftigem Schütteln bei 180 Umdrehungen pro Minute 12 bis 16 Stunden vor der Ernte der Bakterien inkubieren. Gießen Sie die geerntete E.Coli-Kultur in eine 250 Milliliter Zentrifugenflasche und drehen Sie die Zellen bei 14.000 G für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 30 Milliliter Wasser wieder auf.
Übertragen Sie diese Suspension auf ein Zentrifugenrohr, und drehen Sie die Zellen unter Verwendung der vorherigen Bedingungen wieder herunter. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dem Zellpellet 10 Milliliter Chromatographiepuffer hinzu. Wirbel, um die Zellen im Puffer wieder auszusetzen.
Fügen Sie ein Volumen Phenol: Chloroform und Wirbel kräftig, um die Zellen zu brechen. Dann Zentrifuge bei 12.000 G für 10 Minuten. Stellen Sie die wässrige Phase wieder her, fügen Sie ein Volumen Chloroform hinzu und wirbeln Sie kräftig.
Zentrifuge bei 12.000 G für 10 Minuten. Danach filtern Sie die RNA-Vorbereitung durch einen 45-Mikrometer-Spritzenfilter. Reinigen Sie die RNA mit einer ein Milliliter Diethyl-Ethanol-Amin-Säule, die mit einem flüssigen Chromatographiesystem verbunden ist.
Passen Sie den Durchfluss auf einen Milliliter pro Minute an, und gleicht die Spalte mit 10 Milliliter Chromatographiepuffer aus. Dann laden Sie die Probe und waschen Sie die Säule mit 10 Milliliter Chromatographie Puffer. Elute die RNA mit 20 MilliliterElutionspuffer, und sammeln Sie einen Milliliter Aliquots.
Durch die Verwendung der zweidimensionalen Polyacrylamid-Gelelektrophorese trennen Sie die kreisförmigen RNAs von ihren linearen Gegenstücken. Bereiten Sie zunächst ein fünfprozentiges Polyacrylamid-Gel im TBE-Puffer vor, das wie im Textprotokoll beschrieben acht Molharnstoff enthält. Mischen Sie 20 Mikroliter der RNA-Präparate mit einem Volumen Ladepuffer.
Bei 95 Grad Celsius in einem Heizblock für 1,5 Minuten inkubieren und dann auf Eis abkühlen. Die Proben in das Polyacrylamid-Gel laden und die Elektrophorese unter den entsprechenden Bedingungen für die Gelabmessung ausführen. Danach das Gel 15 Minuten lang in 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid färben.
Waschen Sie das gefärbte Gel mit Wasser und visualisieren Sie dann die RNA unter UV-Licht. Die elektrophoretische Analyse mehrerer rekombinanter Plasmide, in die verschiedene cDNAs eingesetzt werden, zeigt im Vergleich zu pLELVd-BZB unterschiedliche Wanderungen. Beachten Sie, dass pLELVd-BZB den lacZ-Marker enthält, der durch die cDNA ersetzt wird, die der RNA von Interesse entspricht, so dass die Migration zwar von der Größe der eingefügten cDNA abhängt, die rekombinanten Plasmide jedoch in der Regel schneller migrieren als das Kontrollplasmid.
Die Produktion der rekombinanten RNA in ko-elektroporated Bakterienkulturen wird überwacht, indem die Zellen gebrochen und die RNA durch Denaturierung von PAGE analysiert wird. Es sind starke Bänder zu sehen, die leeren ELVd- und chimären ELVd-Formularen entsprechen, in die verschiedene RNAs von Interesse eingefügt wurden. Interessanterweise wird ein großer Teil der rekombinanten RNA als kreisförmige Form betrachtet.
Die Zirkularität der Hauptfraktion wird durch die Verwendung einer Kombination von zwei PAGEs unter denaturierenden Bedingungen bei hoher und niedriger Ionenstärke beobachtet. Die RNA-Vorbereitung kann durch Anionenaustauschchromatographie weiter gereinigt werden. Wie hier zu sehen, wird die E.Coli-RNA effizient bei niedriger Ionenstärke zurückgehalten und anschließend bei hoher Ionenstärke eluiert, wobei der größte Teil der RNA in den Fraktionen zwei und drei gesammelt wird.
Rekombinante RNA kann durch 2-D-Elektrophorese weiter auf Homogenität gereinigt werden. Dieses Protokoll ermöglicht die einfache Produktion großer Mengen rekombinanter RNA in Escherichia coli und die Reinigung zur Homogenität dank der Zirkularität des Endprodukts. Denken Sie daran, dass die RNA von Interesse Ergebnisse in einem kreisförmigen RNA-Gerüst aus einem Pflanzenviroid abgeleitet eingebettet.
Wenn Sie beide Moieties trennen möchten, müssen Sie eine Standardstrategie verwenden, wie Ribozyme, DNAzyme oder RNase H. Die Ausbeute dieses Protokolls hängt von der jeweiligen RNA ab, da kleine RNAs wahrscheinlich in höheren Mengen produziert werden als größere. Bei größeren Ausdrücken sollten Sie berücksichtigen, dass die optimale Zeit für die Ernte von Bakterien von vielen Faktoren abhängt, einschließlich des E.Coli-Stamms, des Kulturmediums und der Wachstumsbedingungen. Wir empfehlen ihnen einen Vorzeit-Kurstest, um das optimale Produktionsfenster unter Ihren jeweiligen Bedingungen zu finden.
Denken Sie daran, dass sich die rekombinanten RNAs in Bakterienzellen vorübergehend ansammeln und in der spät wachsenden Phase vollständig verschwinden.
