Dieses Protokoll ist wichtig, weil es dem Benutzer ermöglicht, ein genomisches Expressionssystem zu erzeugen, das alternatives Spleißen durchlaufen kann und in diesem Fall kreisförmige RNAs bildet, die auf ihre Funktion und Krankheitsassoziation getestet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie anderen den Weg ebnen wird, dieses Protokoll in der Molekularbiologie und beim Klonen zu verwenden, wenn sie alternatives Spleißen in der kreisförmigen RNA-Bildung und -Funktion untersucht. Mein Rat an jemanden, der diese Technik zum ersten Mal versucht, wäre, die PCR-Bedingungen zu optimieren.
Führen Sie Gradienten oder führen Sie Touchdown-PCR mit unterschiedlichen Glühtemperaturen und Verlängerungszeiten durch. Normalerweise verlängern längere Fragmente über sechs KB eine KB pro Zyklus und verschiedene Glühtemperaturen müssten auf die beste Verstärkung getestet werden. Die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie den Benutzern eine bessere visuelle Darstellung der schwierigeren Aspekte des Verfahrens, insbesondere der Generierung von Primern, geben wird.
Um dieses Verfahren zu beginnen, laden Sie den UCSC Genome Browser und verwenden Sie ihn, um sich wiederholende Elemente zu identifizieren, die für die kreisförmige RNA-Bildung notwendig sind, und integrieren Sie sie in die Konstrukte. Wichtig ist, dass Primer für die Verstärkung außerhalb der sich wiederholenden Elemente liegen müssen. Fügen Sie die kreisförmige RNA-Sequenz in die menschliche BLAT-Suche ein und wählen Sie den richtigen Organismus aus.
Senden Sie die Sequenz, wechseln Sie zur Browseransicht, und zoomen Sie 1,5 Timer oder ggf.. Als Nächstes bewegen Sie sich mit der Maus über die sich wiederholenden Elemente, um ihren Subtyp in einem unverankerten Fenster zu identifizieren. Alu-Elemente befinden sich in der Sinuslinie.
Verwenden Sie die Schaltfläche "Standardspuren" unter dem Fenster, um den Browser zurückzusetzen, wenn ein falsches Bild abgerufen wird. Gehen Sie zuerst zu sehen, DNA auf der obersten Zeile des USCS Genome Browser, um die DNA-Sequenz im Fenster gezeigt herunterladen. Wählen Sie in der Formatierungsoption Sequenzierung erweiterte Groß-/Kleinformatoptionen aus.
Wählen Sie die Standardgroß-Kleinschreibung als niedriger aus, und wählen Sie die Umschaltgroßteilfürgroßung für NCBI RefSeq aus. Wählen Sie unterstreichen und fett und kursiv für RepeatMasker. Klicken Sie auf Absenden.
Es wird Exons als Großbuchstaben und Introns als Kleinbuchstaben geben. Überprüfen Sie die Exon-/Intron-Grenzen. Wenn der Browser die umgekehrte Ergänzung anzeigt, gehen Sie zurück und wählen Sie das umgekehrte Komplementfeld aus, bis die richtigen Exon-/Intron-Ränder angezeigt werden.
Kopieren Sie als Nächstes die Datei mit der richtigen Ausrichtung in ein Textverarbeitungsdokument, und markieren Sie die Exons. Wählen Sie die zu verstärkenden Fragmente aus, um sicherzustellen, dass das Intron nicht in einem sich wiederholenden Bereich beginnt oder endet, da Primer in diesen Regionen bestimmte Sequenzen nicht verstärken. Verwenden Sie zunächst ein Webtool, um die Primer für das Klonen zu entwerfen.
Fügen Sie für die Vektorsequenz die Einfügestelle als letztes Nukleotid hinzu, und fügen Sie anschließend die Fragmente hinzu. Da die Vektornummerierung nicht mit einer bestimmten Einfügestelle beginnt, befindet sich die Einfügestelle im Vektor und das nachgeschaltete Teil wird vor der Upstream-Sequenz eingelagert. Passen Sie Primer an, wenn ihre Schmelzpunkte mehr als vier Grad Celsius voneinander entfernt sind und nicht in der Verstärkung wirken.
In dieser Studie werden Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen, geklont und analysiert. Optimierte PCR-Produkte werden auf einem 1%Agarose-Gel getrennt, das 1X Gel grün enthält. Die einzelnen Bänder stellen die PCR-Produkte dar, die in der enzymatischen DNA-Montage verwendet werden.
Diese Bänder werden dann aus dem Gel herausgeschnitten und gereinigt. Das gereinigte PCR-Produkt läuft nicht der erwarteten Größe mit Gelgrün, so dass die Produkte auch auf einem 1%Agarose-Gel getrennt werden, das anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt wird, um sicherzustellen, dass die Produkte die richtige Größe haben. Legen Sie zunächst ein enzymatisches DNA-Montageset vor.
Kombinieren Sie den Vektor und fügt in einem Molverhältnis von eins zu zwei. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter DNA-Montage-Master-Mix hinzu. Inkubieren Sie Proben für 60 Minuten bei 50 Grad.
Während der Inkubation kompetente Zellen auf Eis auftauen. Die Zellen sollten ein Volumen von 50 Mikrolitern haben. Als nächstes transformieren Sie kompetente Zellen mit der Gesamtmontagereaktion.
Fügen Sie zwei Mikroliter des gekühlten, zusammengebauten Produkts zu den zuständigen Zellen hinzu. Mischen Sie, indem Sie das Rohr vier- bis fünfmal sanft streichen. Wirbel nicht.
Die Mischung 30 Minuten auf Eis legen. Hitze schockieren die Mischung bei 42 Grad Celsius für 30 Sekunden. Dann legen Sie es wieder auf Eis für zwei Minuten.
Danach 950 Mikroliter Raumtemperatur-SOC-Medien in die Röhre geben. Bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten inkubieren, während bei 300 RPM geschüttelt wird. Während dieser Inkubation zwei Selektionsplatten, die das entsprechende Antibiotikum enthalten, warm.
Zentrifugieren Sie nach der Inkubation das Reaktionsrohr 30 Sekunden lang bei 10.000 g, um die Zellen zu pellet enzieren und 25 % der Zellen auf einer Selektionsplatte und 75 % auf der anderen zu versenken. Bebrüte diese Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bevor Sie mit der Transfektion beginnen, überprüfen Sie Ihre DNA durch Einschränkung Digest.
Hier wird ein repräsentatives Tau-Minigen, das die Exons neun bis zwölf enthält, mit Restriktionsenzymen geschnitten, die auf größere Rekombinationen hinweisen. Für die Transfektion zunächst lineares Polyethylenhydrochlorid in Wasser mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter bei pH 2 auflösen. Verwenden Sie Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf bis zu sieben zu bringen und sterile Filter die Lösung mit einem 0,22 Mikrometer Filter.
Bewahren Sie die Lösung bei vier Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit ist. Dann teilen Sie die Zellen in die Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte und lassen Sie sie über Nacht bei DMEM-Medien mit 10%FBS wachsen. Am nächsten Tag aliquot ein Mikrogramm des gemeldeten Gens in einer sterilen Röhre und fügen Sie 200 Mikroliter steril gefiltertes 150 Millimolar Natriumchlorid hinzu.
Mix durch Wirbel. Als nächstes fügen Sie die Polyethylenimin-Lösung zu diesem Gemisch im Verhältnis von drei Mikroliter Polyethylenimin für jedes Mikrogramm DNA hinzu. Zentrifuge kurz, um Proben an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Fügen Sie es dann direkt zu HEK293-Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Verwenden Sie am nächsten Tag ein RNA-Isolationskit, um die RNA für RT-PCR zu isolieren. cDNA aus zwei Proben aus menschlichen Hirngeweben wird mit kreisförmigen RNA-Primern circ tau exon 1210 reverse und circ tau exon 1211 nach vorne verstärkt. Während das erwartete Band, das tau-zirkuläre RNA entspricht, gesehen wird, sind die anderen starken Bänder Artefakte, die nicht mit dem menschlichen Genom übereinstimmten.
Dieses Experiment wird mit identischen PCR-Bedingungen wiederholt, aber die umgekehrte Transkription wurde nur mit dem circ tau exon 1210 Reverse Primer durchgeführt. Nur das erwartete Band wird durch Sequenzierung verstärkt und validiert. Die RNA wird dann mit RNase R behandelt, die lineare RNA entfernt.
Die kreisförmige RNA ist nach der Behandlung nachweisbar, während lineare RNA kein nachweisbares Signal mehr gibt. RNA wird 24 Stunden nach der Transfektion isoliert und mit RT-PCR analysiert. Die Verstärkung der linearen Tau mRNA zeigt zwei Bänder durch alternatives Spleißen von Exon 10.
Ihr Verhältnis ändert sich zum Überausdruck von Spleißfaktoren. Die Verstärkung der kreisförmigen 1210 tau RNA zeigt die Abhängigkeit der tau circ RNA Expression von der Expression einiger Spleißfaktoren, insbesondere der Cdc2-ähnlichen Kinase CLK2 und des SR-Proteins 9G8. Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist das Design und die Lage der Primer beim Bau eines Minigens.
Die Grundierung sollte nicht in sich wiederholenden Elementen liegen und muss unter verschiedenen Bedingungen optimiert werden, je nachdem, ob das Fragment verstärkt wird. Nach diesem Verfahren werden andere Methoden, die ausgeführt werden können, die Funktion der zirkulären RNAs testen. Die Benutzer können die Übersetzung oder Sequestrierung von Proteinen testen, um eine Funktion für die spezifische kreisförmige RNA zu identifizieren, an der der Benutzer interessiert ist.
Diese Technik ebnete den Weg, um genomische Fragmente in einem Minigensystem zu nutzen, das die kreisförmigen RNAs überausdrücken kann, so dass der Benutzer ihre Funktion und in einigen Aspekten ihre Assoziation mit Krankheiten testen und identifizieren kann. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf mögliche Therapien und Diagnostika einer bestimmten Krankheit, zum Beispiel Tauopathien, neurodegenerative Erkrankungen im Zusammenhang mit Tau-Pathologie. Wir haben entdeckt, dass das mikrotubulieassoziierte Protein Tau, bekannt als MAPT, kreisförmige RNAs erzeugt, von denen wir glauben, dass sie zur Krankheitspathologie beitragen, und diese Methode ermöglicht es uns, diese kreisförmigen RNAs vollständig zu untersuchen und ihre Funktion und Beziehung zu Krankheiten zu identifizieren.
Diese Methode könnte Einen Einblick in ein besseres Verständnis von kreisförmigen RNAs, ihre Funktionen und die Rolle, die sie bei bestimmten Krankheiten spielen können, geben. Diese Methode kann beim Klonen anderer Minigene angewendet werden, die kreisförmige RNAs über Arten hinweg ausdrücken, wo sie Einblicke in ihre Funktion geben können. Die Amplifikation der PCR-Produkte erweist sich als die schwierigste mit langen Fragmenten, die aus der genomischen DNA verstärkt werden, zusammen mit mehreren sich wiederholenden Elementen innerhalb des Fragments.
