Unser Protokoll zur zellfreien Proteinexpression verwendet hochaktiven Rohextrakt aus dem schnell wachsenden Bakterium Vibrio natriegens, das mit einem einfachen und zeiteffizienten zweistufigen Beschallungsprozess hergestellt wird. Die Herstellung von Rohzellextrakten und die zellfreie Proteinsynthese können in ein bis zwei Tagen von einem einzigen Benutzer erreicht werden, so dass diese Technik problemlos in Pipelines für die Bioproduktion oder synthetische Biologie integriert werden kann. Um einen Milliliter der über Nacht Vibrio natriegens Kultur zu waschen, indem Sie es in einer Tischzentrifuge bei 10, 600 mal g für eine Minute zentrifugieren.
Den Überstand ansaugen, ohne das Pellet zu stören, und in einem Milliliter frischer LB-V2-Medien wieder aufsetzen. Impfen Sie einen Milliliter gewaschener Nachtkultur in einen Liter frischer LB-V2-Wachstumsmedien in einem autoklavierten Vierliter-Verwirrten Erlenmeyerkolben mit steriler Abdeckung, um eine Verdünnungsration von eintausend tausend zu erreichen. Wachsen Kultur bei 30 Grad Celsius beim Schütteln bis 225 RPM.
Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Kulturen OD 600 zu überwachen. Und wenn es 1,0 plus oder minus 0,2 erreicht, ernten Sie die Kultur, indem sie sie in zwei 500-Milliliter-Röhren bei 3, 500 mal g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert und dann auf Eis legen. Den Überstand ansaugen und das Pellet sofort verarbeiten.
Vor Beginn des Zelllyseverfahrens frisch zubereitete S30-Lysepuffer pH 7,7 bis etwa vier Grad Celsius abkühlen, Verwenden Sie 10 Milliliter dieses kalten S30-Lysepuffers, um alle Pellets, die aus derselben Ein-Liter-Kultur resultieren, wieder aufzuhängen. Und die Suspension in ein 50-Milliliter-Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie diese Suspension bei 3, 500 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, und aspirieren Sie dann den Überstand, ohne das Pellet zu stören und auf Eis zu legen.
Bei der Arbeit in einem Kalten Raum werden dem Pellet in der 50-Milliliter-Röhre, die auf Eis gelegt wird, 500 Mikroliter kalten S30-Lysepuffer hinzufügen. Verwenden Sie eine breite Bohrung Pipettenspitze, um das Pellet wieder aufzuhängen und vorsichtig auf ein Zwei-Milliliter-Rohr auch auf Eis übertragen. Um sehr aktive Rohextrakte zu produzieren, müssen wir sicherstellen, dass die Zellen nicht mit S30-Puffer überverdünnt sind, sondern über genügend Flüssigkeit für eine effiziente Beschallung verfügen.
Füllen Sie einen 600-Milliliter-Becher mit Eis und legen Sie einen Zwei-Milliliter-Rohrhalter auf das Eis. Wirbeln Sie die Röhre kurz, um die Zellen zu homogenisieren. Flick, um alle Zellen auf der Unterseite der Kappe zu entfernen, und legen Sie in Rohrhalter mit Kappe offen.
Niedrigere Beschallungsspitze in die Zellsuspension im Rohr, so dass sie sich knapp unter der flüssigen Oberfläche befindet. Bereiten Sie die Beschallung mit einem Beschallungsgerät und einer Sonde mit einem Spitzendurchmesser von 1/8 Zoll vor. Stellen Sie den Beschallungsgerät auf 20 Kilohertz Frequenz und 50%Amplitude ein.
Puls-On-Zeit von 10 Sekunden und Puls-off-Zeit von 60 Sekunden. Führen Sie das Pulsschallungsprotokoll für drei Zyklen aus. Und dann Zentrifuge Rohzellextrakt bei 16.000 mal g für 30 bis 45 Minuten bei vier Grad Celsius, bis Lysat frei von Zellablagerungen ist.
Die visuelle Inspektion der Zelllyse während der Beschallung ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Beschallung wie erwartet funktioniert hat. Arbeiten in einem kalten Raum aliquot 50 Mikroliter der resultierenden Überstand zu neuen Zwei-Milliliter-Röhren sicherstellen, dass das Pellet nicht stören. Um zu blitzen, legen diese rohen Zellextrakte die Rohre in einen Rohrhalter mit einer Tauchschnur befestigt und tauchen in einen Dewar mit flüssigem Stickstoff und überprüfen, ob gefroren.
Um die zellfreie Proteinexpression mit DNA-Vorlagen-Tauton 10X Energielösung Master-Mix, 4X Aminosäure-Master-Mix-Aliquots und DNA-Vorlage bei Raumtemperatur durchzuführen. Dann entfernen Sie die T7-RNA-Polymerase- und RNAse-Inhibitorbestände aus dem Gefrierschrank von minus 20 Grad Celsius und legen Sie sie auf Eis. Sobald die DNA-Vorlage, 10X Energielösung Master-Mix, und 4X Aminosäure Master-Mix aufgetaut sind, auf Eis legen.
Bereiten Sie einen zellfreien Reaktionsmaster-Mix vor, indem Sie jede Komponente in der genauen Reihenfolge zu einem Zwei-Milliliter-Rohr auf Eis hinzufügen, und nach jeder Zugabe des Master-Mix sanft die Röhre bewegen. Entfernen Vibrio natriegens Rohzelllysat aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank und legen Sie auf Eis für 10 bis 20 Minuten, bis aufgetaut. Fügen Sie das entsprechende Volumen des aufgetauten Rohzellextrakts in den zellfreien Reaktionsmaster-Mix und mischen Sie es vorsichtig mit einer Pipette.
Um die endpunktfreie Proteinexpression mit Thermocycler durchzuführen, fügen Sie zunächst 10 Mikroliter des zellfreien Reaktionsmaster-Mix pro Bohrung des Bodens einer 96-Well-PCR-Platte hinzu, um sicherzustellen, dass der Master-Mix durch sanftes Streichen des Rohres zwischen den einzelnen Übertragungen auf die PCR-Platte gemischt wird. Zentrifugieren Sie die Platte 1000 mal g für 10 Sekunden, um jede Master-Mischung zu bündeln, die an den Seiten der Brunnen geklebt worden sein könnte. Und dann versiegeln Sie die Brunnen mit einem Plattenkleber, um Verdunstung zu verhindern.
Legen Sie die Platte in einen Thermocycler auf 26 Grad Celsius mit einem beheizten Deckel auf 105 Grad Celsius eingestellt. Nach der Inkubation der Reaktionen in der PCR-Platte für mindestens drei Stunden können exprimierte Proteine gereinigt, quantifiziert und für nachgelagerte Prozesse verwendet werden. Zur Überwachung der zellfreien Proteinexpressionskinetik mit einer Plattenleserpipette 10 Mikroliter pro Brunnen des zellfreien Reaktionsmeister-Mixes auf den Boden einer schwarzen 384-Well-Assay-Platte mit klarglasböden.
Und versiegeln Sie die Brunnen mit einem klaren Plattenkleber, um Verdunstung zu verhindern. Legen Sie die Assayplatte in einen Plattenleser, der auf 26 Grad Celsius eingestellt ist, und brüten Sie drei bis sechs Stunden, während Sie die entsprechenden fluoreszierenden Anregungs-/Emissionswellenlängen überwachen, die dem exprimierten Protein entsprechen. Das in diesem Protokoll beschriebene zellfreie Expressionssystem erzielt die besten Ergebnisse mit einer Plasmid-DNA-Vorlage, die eine signifikant höhere Menge an Protein liefert als die gleiche Menge an linearer DNA, wie sie durch Endpunkt- und kinetische Assays gezeigt wird.
mRNA, die durch In-vitro-Transkriptionsreaktionen erzeugt wird, könnte ebenfalls verwendet werden, aber es sind höhere Mengen an mRNA erforderlich. Die Ausbeute der Proteinproduktion wurde durch die Konzentration von Magnesium- und Kaliumionen erheblich beeinflusst. Unter optimierten Bedingungen wurde die optimale Magnesiumionenkonzentration bei 3,5 Millimolar und für Kaliumion, 80 Millimolar, ermittelt.
Daher können Abweichungen von diesen optimalen Ionenkonzentrationen zu einer verminderten Fähigkeit dieses Expressionssystems führen, signifikante Proteinerträge zu erzeugen. Es ist wichtig, alle Reagenzien auf Eis zu halten oder so weit wie möglich in einem Kühlraum zu arbeiten. Darüber hinaus ist eine ordnungsgemäße und vollständige Beschallung entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls.
Nach diesem Protokoll benutzer haben die Fähigkeit, Proteine in einem High-Throughput-Format auszudrücken, die verwendet werden können, um zu reinigen und Bildschirm für die Aktivität von vielen verschiedenen Proteinen. Diese Technik demonstriert die Verwendung neuer Organismen mit einzigartigen Eigenschaften für die zellfreie Expression. Vibrio natriegens ist ein halophiles schnell wachsendes Bakterium, das einzigartige Bedingungen für die Expression von Proteinen oder kleinen Molekülen bieten kann, die bisher in etablierten Modellorganismen unerforscht waren.
