Willkommen am Institut für Zellbiologie und Pathologie, Nicolae Simionescu aus Bukarest, Rumänien. Hier im Viral Transduction Laboratory zeigen wir einen Teil der adenoviralen Partikelproduktion mit einer optimierten Methodik auf Basis des von Professor Vogelstein entwickelten AdEasy-Systems. Die wichtigsten Schritte der Technologie zur Herstellung dieser Adenoviren sind zum einen eine Rekombination von pAdTrack enthaltendem GFP mit dem pAdEasy-1-Plasmid in BJ5183-Bakterien.
Zweitens, die adenoviralen Partikel zu verpacken. Drei, Amplifikation des Adenovirus in AD293-Zellen. Vier, Reinigung der adenoviralen Partikel aus Zelllysat und Kulturmedium.
Fünf, virale Titration und funktionelle Tests des Adenovirus. Hier werden wir einen wichtigen Schritt der Methodik vorstellen. Die Reinigung der adenoviralen Partikel aus Zelllysat und Kulturmedium.
Die Reinigung des Adenovirus beginnt mit der Ernte der virusproduzierenden Zellen und des Mediums. AD293-Zellen wurden mit dem rekombinanten Plasmid transfiziert und als Adenovirus verpackt. Dann wurde das Adenovirus durch aufeinanderfolgende größere Kulturen verstärkt.
Hier erhielten wir 25 T175 Platten, und wir begannen mit der Reinigung des Adenovirus aus dem Zelllysat und dem Kulturmedium. Zuerst überprüften wir die grüne Fluoreszenz des GFP, ausgedrückt durch die transduzierten Zellen. Wenn die Zellen noch befestigt sind, lösen wir sie, indem wir auf die Kulturschale tippen oder einen langen Schaber verwenden.
Die Zellen und das Medium werden gesammelt. Die Kolben werden mit PBS gewaschen, das auch in Falcon-Rohren gesammelt wird. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert.
Bewahren Sie das Zellpellet sowie das Medium zur weiteren Reinigung des Adenovirus auf. Bei diesem Schritt wird die Hilfe eines Kollegen sehr geschätzt, um den Ernteprozess zu beschleunigen. Das Zellpellet ist aufgrund der GFP-Expression grün.
Das Pellet wird im hypertonischen Tris-Puffer resuspendiert, was die Störung der Zellen erleichtern würde. Für die Zelllyse verwenden wir flüssigen Stickstoff und das Trockengas wird auf 37 Grad erwärmt. Führen Sie nicht mehr als drei Zyklen durch, da das Virus beschädigt wäre.
Um die Effizienz der Zellunterbrechung zu erhöhen, passieren Sie vorsichtig die Zellhomogenisierung durch eine 23 Gauge Spritzennadel. Zentrifugieren Sie die Zelle 12 Minuten lang bei 9, 600 x g. Übergeben Sie den Überstand in neue Schläuche und entsorgen Sie die Pellets.
Halten Sie den Überstand zur Weiterverarbeitung durch Ultrazentrifuge auf Eis. Jetzt verarbeiten wir das Kulturmedium, um das aus den Zellen freigesetzte Adenovirus zu isolieren. Dazu gewichten wir zunächst die notwendige Menge Anmoniumsulfat und fügen sie der Flasche hinzu, in der das Kulturmedium gesammelt wurde.
Die Flasche wird kräftig geschüttelt, bis die Kristalle vollständig aufgelöst sind. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für zwei Stunden und die Hälfte inkubiert. Dann wird die Aufhängung des Niederschlags in Falcon-Rohre unterteilt.
Zentrifuge für 15 Minuten bei 1, 600 x g. Nach der Zentrifugation wird der Überstand entsorgt und das Pellet in 10 Millimolaren Tris-Puffer wieder aufgehängt. Wenn man die Reinigung des Adenovirus mit dem Ultrazentrifugationsschritt nicht fortsetzen kann, kann der Niederschlag für ein paar Tage bei vier Grad gehalten werden, aber erst nach der Dialyse, um das Ammoniumsulfat zu entfernen.
Hier haben wir den Dialyseschritt vorgestellt. Wir verwenden eine Spritze, um die Suspension in eine zuvor benetzte Kassette einzuführen. Die Proben werden über Nacht bei vier Grad gegen 10 Millimolaren Tris-Puffer dialyziert.
Der letzte Schritt der Reinigung wird durch den Ultrazentrifugationsschritt auf einem Cäsiumchlorid diskontinuierlichen Gradienten dargestellt. Um den Gradienten zu bilden, pipetten wir zunächst drei Milliliter der Hochdichtelösung cäsiumchlorid. Auf dieser Schicht, vorsichtig gießen Sie drei Milliliter niederdichten Cäsiumchlorid.
Die adenovirale Partikelsuspension aus dem Zelllysat oder dem Kulturmedium wird dann über dem Gradienten überlagert. Die Rohre werden mit Mineralöl gefüllt und in die SW41-Eimer eingeführt. Nach dem Ausgleich werden die Rohre symmetrisch in den Rotor geladen, der in die Ultrazentrifuge eingeführt wird.
Die Zentrifuge läuft 18 Stunden lang ohne Pause 35 000 U/min und vier Grad. Nach der Ultrazentrifugation werden die Rohre auf einen Ständer mit einem schwarzen Papier hinten gelegt, um die Bänder zu ernten. Die klare obere Phase und der Zellabfall werden in einem Abfallbehälter mit einer Bleichlösung entsorgt.
Das unterste Band, das das komplette Adenovirus enthält, wird mit einer Pipettenspitze geerntet und in einem sterilen Eppendorfrohr gesammelt. Nach der Dialyse wird Saccharose der viralen Suspension zu einer Endkonzentration von 4% zugesetzt und virale Aliquot werden bei minus 80 Grad eingefroren. Im Ergebnisbereich zeigten wir die GFP-Expression in Zellen, die mit dem erhaltenen Adenovirus transduziert wurden.
48 Stunden nach der Transduktion wird GFP durch die transduzierten Zellen exprimiert, wie die Fluoreszenzmikroskopie zeigt. Der Prozentsatz der GFP-exemittierenden Zellen wird durch Durchflusszytometrie bestimmt. Etwa 50% der humanen und rindern Endothelzellen, die mit 25 Transduktionseinheiten pro Zelle transduziert wurden, sind GFP-positiv.
Die gleiche Transduktionsausbeute wurde für murine Hepatozyten erzielt, wenn nur fünf Transduktionseinheiten pro Zelle verwendet wurden, aber dies ist mit einer höheren Mortalität aufgrund der Zellempfindlichkeit verbunden. Reduziert auf GFP-Expression wurde durch Transduktion von mesenchymalen Stromalzellen aufgrund der geringen Expression der spezifischen Rezeptoren erhalten. Schlusswort.
Wir optimieren diese mühsame Technologie, um die Zeit, die Kosten und den Aufwand zu reduzieren, der erforderlich ist, um die adenoviralen Partikel zu erhalten. Das hergestellte Adenovirus ist in der Lage, verschiedene Zelltypen zu infizieren und die Expression des Gens von Interesse zu induziert.
