Diese Methode kann helfen, die Frage zu beantworten, wie die INTEGRATION von HIV-Proviren die androgyne Genexpression beeinflusst und warum bestimmte genomische Integrationsstandorte in letzter Zeit in HIV-infizierten Zellen ausgewählt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass In-vitro-Modelle für HIV-Infektionen produziert werden können, die provirale Reporter tragen, die auf ausgewählte Integrationsstandorte mit CRISPR/Cas9-basierter Genom-Engineering ausgerichtet sind. Das Verfahren wird Thomas Walther, ein Doktorand, und Julia Bialek, ein Postdoc aus meinem Labor, demonstrieren.
Beginnen Sie mit UCSC Genome Browser, um die genomische Sequenz des gewünschten genomischen Lokus zu extrahieren, auf den gezielt ausgerichtet werden soll. Um Die Tonleiter-RNAs von 20 Nukleotiden für die Ausrichtung des gewählten genomischen Lokus zu wählen, verwenden Sie das E-CRISP-Webtool. Wählen Sie dann Homo Sapiens Genome Reference Consortium Human Genome:Build 38 aus.
Referenzgenom als Organismus und Input 2 000 Basenpaare der genomischen Sequenz, die den zuvor extrahierten gewünschten genomischen Ort abdecken. Starten Sie eine Guide-RNA-Suche mit mittleren Anwendungseinstellungen mit jedem PAM, alle Fünf-Prim-Basen, Off-Targets tolerieren Inkongruenzen und ausgeschlossene Introns und CPG-Inseln. Wählen Sie aus der Liste mit möglichen Guide-RNA-Designs eine Guide-RNA mit einer hohen Punktzahl für Spezifität und Effizienz aus, die dem gewünschten genomischen Ort, der zielgerichtet werden soll, möglichst nahe kommt.
Öffnen Sie den NCBI Blast-Browser, um die gewählte Guide-RNA-Sequenz gegen das Referenzgenom zu sprengen. Um die Eindeutigkeit der ausgewählten Guide-RNA-Bindungsstelle zu überprüfen, wählen Sie zuerst den Menschen als Genom aus und geben dann die Guide-RNA-Sequenz als Abfragesequenz ein. Wählen Sie dann sehr ähnliche Sequenzen oder Mega Blast als Programm aus, um sicherzustellen, dass die Guide-RNA-Sequenz einzigartig ist.
Danach wählen Sie in-silico 1.000 Basenpaare, vor- und nachgelagert edownstream der Guide-RNA-Sequenz aus der genomischen Sequenz, die zu Beginn extrahiert wurde. Verwenden Sie diese ausgewählten 1 000 Basenpaare, vor- und nachgelagert als Fünf-Prim- und Drei-Prim-Homologiearme, um vektorions- und angrenzende Reportersequenzen zu zielen, um gezielt zu sein. 24 Stunden vor der Transfektion von Jurkat-T-Zellen, bereiten Sie eine komplette 6-Well-Platte der Zellen für ein einzelnes Targeting-Experiment vor.
Zu Beginn, Platte 1, 250, 000 Zellen in 2,5 Milliliter RPMI 1640 mit Ergänzungen und ohne Antibiotika, pro Brunnen. Am folgenden Tag zu Mikrogramm kreisförmigen Targeting-Vektor und zwei Mikrogramm Cas9 und Guide-RNA-Expressionsplasmid pro Brunnen, zu 250 Mikrolitern kommerziellen RPMI-Mediums für die Transfektion optimiert, in einem Reaktionsröhrchen und mischen gut durch Wirbel. Dann langsam 12 Mikroliter Transfektionsmittel in das DNA-Medium geben, ohne die Wand des Rohres zu berühren.
Streichen Sie das Rohr und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie die Mischung tropfenweise zu einem Brunnen von Zellen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Und 72 Stunden nach der Transfektion ziehen Sie die transfizierten Zellen, zählen Sie sie und bereiten Sie sich auf die Anreicherung durch FACS vor. Nach der Bestätigung der Targeting-Ereignisse in der gemischten Zielzellpopulation beginnen Sie mit der Erzeugung von einzelzelligen Klonen, indem Sie jurkat-konditioniertes Medium im Voraus vorbereiten, indem Sie RPMI mit Antibiotika aus gesunden, unbehandelten Jurkat-T-Zellen sammeln. Zentrifugieren Sie die Schläuche 5 Minuten bei 300 G und filtern Sie den Überstand mit einer 25-Milliliter-Spritze, indem Sie einen 0,22-Mikrometer-Filter in neue, 50 Milliliter konische Schläuche filtern.
Zählen Sie die zielgerichteten Zellen, die zuvor mit FACS angereichert wurden, 10 bis 14 Tage nach der Expansion, und verdünnen Sie sie dann in RPMI mit Antibiotika auf eine Konzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter. Verdünnen Sie 100 Mikroliter dieser Zellverdünnung mit 9,9 Millilitern Medium, um 1.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Dann einen Milliliter dieser Verdünnung mit neun Millilitern Medium auf eine Konzentration von 100 Zellen pro Milliliter verdünnen.
Um 96 Brunnenplatten zu verblechen, um eine Zelle pro Brunnen zu enthalten, mischen Sie vorsichtig einen Milliliter 100-Zellen-pro-Milliliter-Lösung mit fünf Millilitern Konditionsmedium und vier Milliliter frisches Medium in einem sterilen Reagenzreservoir. Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 100 Mikroliter der jeweiligen Zellverdünnung pro Brunnen der neuen 96-well runden Bodenplatten hinzuzufügen, um eine und zwei Zellen pro Brunnenverdünnung zu erreichen. Stapeln Sie die 96 Brunnenplatten und bedecken Sie jeden Stapel mit einer Sechs-Well-Platte, die drei Milliliter PBS pro Brunnen enthält.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid, für drei Wochen. Nach der abgeschlossenen Inkubation, visuell bestätigen das Vorhandensein von gewachsenen Kolonien mit Lichtmikroskopie mit vierfacher Vergrößerung, und markieren Sie die Brunnen mit gewachsenen Kolonien. Heben Sie die Zellen eines durch Pipettieren gut markierten Zellen vorsichtig wieder aus.
100 Mikroliter dieser Zellsuspension in einen Brunnen frisch zubereiteter 96-gut runder Bodenplatte mit 100 Mikroliter RPMI mit Antibiotika pro Brunnen übertragen und für alle markierten Brunnen wiederholen, sanft durch Pipettieren mischen. Um die Platte zu duplizieren, übertragen Sie 100 Mikroliter dieser Zellsuspension in eine zweite leere, 96-well runde Bodenplatte und wiederholen Sie diesen Vorgang für alle markierten Brunnen. Schließlich füllen Sie die leeren Brunnen mit 200 Mikroliter RPMI mit Antibiotika.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nachdem die doppelte Platte für 24 bis 48 Stunden inkubiert hat, duplizieren Sie es wieder, indem Sie 100 Mikroliter RPMI mit Antibiotika zu jedem Brunnen hinzufügen. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um sanft zu mischen und übertragen Sie 100 Mikroliter auf jeden Brunnen einer neuen 96-Well-Rundbodenplatte.
Legen Sie eine dieser beiden doppelten Platten in den Inkubator. Verwenden Sie die zweite der neuen doppelten Platten für die Durchflusszytometrie, indem Sie zunächst fünf Mikroliter PMA/Ionomycin Master Mix pro Brunnen hinzufügen, um die Zellen zu stimulieren. 24 Stunden lang inkubieren und die Zellen auf die im Text beschriebene Durchflusszytometrie vorbereiten.
Beorgatten Sie alle lebensfähigen Einzelzellen basierend auf der Größe in vorwärts und seitlich streuen. Analysieren Sie die fluoreszierende Reporter-Genexpression durch Durchflusszytometrie. Um einzellige Klone nach PCR zu überprüfen, entwerfen Sie die Primer P5 und P6 zum Screening von PCR basierend auf der gewählten Reportersequenz, um 500 bis 800 Basispaare der Reportersequenz zu verstärken.
Für positiv steuernPCR, Design-Primer P7 und P8, die 630 Basenpaare eines wilden, nicht zielgerichteten genomischen Lokus verstärken. Entwerfen Sie ein drittes Primerpaar, das 500 bis 600 Basispaare des Targeting-Vektor-Backbones als Steuerelement für die unspezifische Integration von Targeting-Vektor-Backbone-Sequenzen verstärkt. Sobald die Klone in der zweiten doppelten Platte ausreichend gewachsen sind, bereiten Sie sie für das PCR-Screening vor, indem Sie die Platte zunächst 10 Minuten bei 300-G bei Raumtemperatur zentrieren.
Nehmen Sie den Überstand vorsichtig ab, um sicherzustellen, dass das Zellpellet nicht gestört wird. Waschen Sie die Zellen mit 100 Mikroliter PBS durch sanfte Pipettierung, Zentrifugieren der Platte für fünf Minuten bei 300 G bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 200 Mikroliter Lysepuffer pro Brunnen hinzu.
Pipette sanft zu mischen, und übertragen Sie die Federung auf eine neue PCR-Platte. Versiegeln Sie die Platte mit Paraffinfolie und brüten Sie eine Stunde bei 55 Grad Celsius in einem Thermocycler. Nachdem Sie zellzerlegte Zellreste mit maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten zentrifugieren, übertragen Sie den Überstand auf eine neue PCR-Platte.
Fügen Sie 10 Mikroliter dieser Zelle lysiert zu jedem Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte gefüllt mit 110 Mikroliter destilliertem H2O, pro Brunnen. Dann für 10 Minuten bei 99 Grad Celsius in einem Thermocycler inkubieren, um Proteinase K.Use 2 Mikroliter dieser Zelle Lysat als Vorlage zu inaktivieren und verwenden Sie einen kommerziellen PCR-Master-Mix für Screening, Steuerung und Backbone PCR. Führen Sie PCR für 38 bis 40 Zyklen PCR-Verstärkung in einem 96-Well-Format aus.
Verwenden Sie fünf Mikroliter PCR-Produkte und führen Sie sie auf einem 1,5%agarose TAE Gel, um die Durchflusszytometrie und PCR-Ergebnisse zu analysieren und zu kombinieren, um Einzelzellklone zu bestätigen. Die Reporter-Genexpression nach PMA/Ionomycin-Induktion wurde je nach Integrationsstandort sowohl durch Durchflusszytometrie als auch pcR in vier bis zwölf% der Zellen bestätigt. Die PCR-Analyse der genomischen DNA mit Primern für die Integration von Fünf- und Drei-Primin-Verbindungen bestätigt, dass Zielereignisse aufgetreten sind.
Nach dem Screening von Einzelzellklonen auf korrektes Targeting durch Durchflusszytometrie wurden Klone mit hoher, niedriger und keiner fluoreszierenden Reporter-Genexpression beobachtet. Einzelzellklone wurden auch von PCR mit reporterspezifischen Primern und Steuerprimern bestätigt. Klone, die positiv im Screening pcR bestätigt wurden, wurden aufgebraucht und weiter analysiert, um das richtige Targeting durch Southern Blot zu verwenden, indem eine reporterspezifische Sonde und eine Genom-Sonden-Bindung außerhalb des Reporters verwendet wurden.
Nur ein Teil zeigte korrekte Bandgrößen in der Southern Blot-Analyse und hatte den Reporter heterozygly integriert, was zeigt, dass es wichtig ist, pcR-Ergebnisse durch Southern Blot zu überprüfen. Klone wurden auch durch Sequenzierung analysiert, um positive einzellige Klone weiter zu bestätigen. Sequenzierung der Zielseite:homologes Allel, wenn der Reporter nicht integriert hatte, offenbarte Cas9-induzierte Mutationen.
Einmal gemeistert, kann die Generierung von HIV-Reporter-Linien in zwei bis drei Monaten erreicht werden. Vor dem Targeting ist es wichtig, genügend Zeit mit der Auswahl einer Integrations-Site bei und einem geeigneten Reporter zu verbringen, abhängig von der Forschungsfrage, die Sie angehen möchten. Reporter können beispielsweise auf Wunsch verschiedene HIV-Regulierungselemente einschließen.
Nach diesem Verfahren können Zelllinien beispielsweise verwendet werden, um die Auswirkungen verschiedener Latenzauftriebe auf die Transkriptionsaktivität des Reporter-LTR zu testen, je nach Integrationsstandort. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie integrations-standortspezifische HIV-Reporter-Linien generieren können, um Guide-RNAs zu entwerfen und Vektoren zu zielen, CRISPR/Cas9-basierte Genom-Engineering in Jurkatzellen durchzuführen, Einzelzellklone zu produzieren und durch FACS- und PCR-Screening für richtig ausgerichtete Klone auszuwählen. Vergessen Sie nicht, dass Sie unter BSL3-Sicherheitsbedingungen arbeiten müssen, wenn Sie mit einem replikationskompetenten HIV-Reporter zusammenarbeiten.
