Diese Maßnahme kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten. Auf dem Gebiet der Humanologie. Diese Antwort in der Funktion von Makrophagen unter physiologischen Ende pathologischen Bedingungen.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Polyethylenimin beschichtet effizient en vitro en vitro kann, ohne die Zelle zu beeinträchtigen. Unter optimalen Dosen. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie und Diagnose vieler chronisch entzündlicher Erkrankungen und Krebserkrankungen.
Wo Makrophagen eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese spielen. Demonstrieren datilisch wird das Verfahren Na Jia sein. Ein Student aus meinem Labor.
Und Kaixuan Wang, ein Doktorand aus Dr.Xiaohuas Labor. Zur Herstellung von Allylsäure modifiziertsuper paramagnetische Eisenoxid-Nanopartikel oder SPION es erste hinzufügen 28 Gramm Pharaschlorid Hexahydrat. Und 20 Gramm Pharas selbst heptahydrat zu einem Becher mit 80 Milliliter entionisiertem Wasser.
Und verwenden Sie einen Glasschlauch, um Stickstoff in die Lösung einzuführen. Rühren, bis sich die feste Materie aufgelöst hat. Erhitzen Sie das Reaktionsgemisch auf 72 Grad Celsius unter Rühren bei 800 Umdrehungen pro Minute.
Und fügen Sie 40 Milliliter 28%Ammoniakwasser in den Becher. Nach fünf Minuten fügen Sie neun Milliliter Allylsäure Tropfen klug. Und halten Sie die Mischung bei 72 Grad Celsius für drei Stunden mit kontinuierlichem Rühren.
Am Ende der Inkubation die resultierende Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Und gefällt das Gemisch durch magnetische Trennung nach Standardprotokollen. Dann waschen Sie den SPION, der Ausscheidung enthält, dreimal mit absolutem Ethylalkohol.
Und asperse den Niederschlag in 100 Milliliter n-Hexan. Zur Herstellung von Dimercapto Acrylsäure modifiziert eIAs fügen Sie 800 Milligramm der Allylsäure modifiziert eISIs. In 200 Milliliter n-Hexan und 400 Milligramm Dimercapto-Acrylsäure in 200 Milliliter Aceto in einem Drei-Hals-Kolben bei 60 Grad Celsius dispergiert.
Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter Triethylamin tropfen weise in den Kolben mit Rühren bei 1000 Umdrehungen pro Minute und Refluxing. Ein schwarzer Niederschlag kann durch magnetische Trennung nach fünf Stunden erhalten werden. Verwenden Sie dann Tetramethylammoniumhydroxid, um den pH-Wert der Lösung für homogene Dispersionen der hydrophilen SPIONiAs in entionisiertem Wasser einzustellen.
Degenerierte Polyethylen-beschichtete SPION es fügen die Dimercapto Acrylsäure modifiziert eIsSPIs kolloidale Lösung tropfen klug in eine 10 Kilodalton Polyethyleneimin Lösung. In einem 500 Milliliter Dreihalskolben unter mechanischem Rühren bei 1000 Umdrehungen pro Minute für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation die resultierende Lösung zu einem Ultrafiltrationsrohr mit einem Molekulargewicht von 100 Kilodalton und einem Inhalt von 15 Millilitern hinzufügen.
Zentrusen Sie die Probe, bis die verbleibende Lösung ein Volumen von einem Milliliter erreicht. Fügen Sie deionisiertes Wasser in die Lösung, um das Volumen wieder auf 15 Milliliter zu bringen. Und zentrrafuse und rehydrieren Sie die Lösung zehn Mal mehr, wie gerade gezeigt.
Filtern Sie die Lösung dann durch einen 22-Mikron-Filter für die Lagerung bei vier Grad Celsius. Zur Herstellung der siRNA-Nanopartikel werden zunächst drei Mikroliter frisch zubereiteter 20 mikromolarer siRNA-Lösungen in fünf beschriftete, mikrozentrische Röhrchen der RNA hinzugefügt. Und fügen Sie 0, 8, 1,6, 3,2 und 6,4 Mikrogramm Polyethylen-IISIAs zu Denröhrchen mit der Bezeichnung Null, eins, zwei, vier und acht hinzu.
Nach dem Mischen mit sanfter Pipettierung die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, damit sich die Polyethyleneimin-SPION siRNA-Komplexe bilden können. Und bereiten Sie ein drei Prozent Agarose Gel mit I Reinheit Agarose. Am Ende der Inkubation einen Mikroliter 6X DNA-Ladepuffer pro fünf Mikroliter Probe in jede Röhre geben und sorgfältig mischen.
Dann alle Proben auf das Gel laden. Und laufen Elektrophorese bei fünf Volt pro Zentimeter. Bis der Bromphenolblaufarbstoff zwei Drittel der Länge auf das Gel wandert.
Einen Tag vor der Transfektion waschen Sie eine Maus Mikrophage wie RAW264.7 Zellkultur mit PBS. Und behandeln Sie die Zellen mit einem Milliliter 25%Trypsin für fünf bis zehn Minuten bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator. Wenn sich die meisten Zellen gelöst haben.
Inaktivieren Sie das Trypsin mit fünf Millilitern kompletter DMEN. Dann pippete die Lösung mehrmals, um alle Zellcluster zu dispergieren. Übertragen Sie die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein steriles 15-Milliliter-Conackelrohr.
Dann setzen Sie die Zellen in fünf Milliliter n frischer kompletter DMEN zum Zählen wieder aus. Verdünnen Sie die Zellen auf 4,5 mal zehn bis vier Zellen pro Milliliter vollständiger DMEN-Konzentration. Und fügen Sie zwei Milliliter Medium zu jedem Brunnen einer sechs Brunnenplatte für eine 24-Stunden-Inkubation im Zellkultur-Inkubator hinzu.
Am nächsten Tag bereiten Sie das entsprechende Verhältnis von Polyethylenimin SPION siRNA Nanopartikeln in einem 1,5 Milliliter RNA-Stream-Mikrozentrifugenrohr mit sanfter Mischung vor, wie gerade gezeigt. Und fügen Sie das entsprechende Volumen von Polyethylenimin SPION siRNA Nanopartikel-Komplex zu jedem Brunnen, die durch einen Milliliter frisches Medium ersetzt wurde. Bereiten Sie Polyethyleneimin SPION si Komplexe vor.
in diesem Fall können noch viele weitere Monate Polyethylenimin SPION verwendet werden, wodurch ihre potenzielle Toxizität minimiert wird. Dann wirbeln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Nanopartikel über die Brunnenböden zu erreichen. Geben Sie die Platte bis zur anschließenden zellulären Aktualisierung oder Gen-Knockdown-Mangelanalyse an den Zellkultur-Inkubator zurück.
Polyethyleneimin-SPIONs mit einem Zeta-Potenzial von 30,5 und 37 Millivolt weisen bei Konzentrationen von bis zu 30 Mikrogramm Eisen pro Milliliter keine offensichtliche Zytotoxizität auf. Das ist etwa zweifach ermietend als die Konzentration, die normalerweise für die Zelltransfektion verwendet wird. Polyethylenimin EIAs Zeta-Potenzial von 48 Millivolt sind jedoch giftig.
Auch bei der niedrigsten untersuchten Dosis. Wie durch Durchflusszytometrie analysiert, können mehr als 90% der Zellen mit fluoreszierend markierten Polyethyleneimin SPION siRNA-Komplexen mit 15 Mikrogramm Eisen pro Milliliter transfiziert werden. Die Beurteilung der Auswirkungen von Polyethylenimin SPION siRNA-Konzentrationen auf die zelluläre Internalisierung durch Zerkleinern von blauer Färbung zeigt eine minimal nachweisbare Färbung mit 7,5 Mikrogramm Eisen pro Milliliter.
Aber deutlich sichtbare Flecken bei 15 Mikrogramm Eisen pro Milliliter, die bei höheren Eisenkonzentrationen wahrscheinlich aufgrund der Polyethyleneimin SPION siRNA Aufnahmesättigung nicht ansteigen. Peritoneale Makrophagen, die mit Polyethyleneimin EIUsIUsiAs spezieller siRNA transfiziert wurden, weisen im Vergleich zu unspezifischer siRNA eine signifikante Abnahme der Targe-mRNA-Spiegel auf. Der Vorschlag, dass siRNA aus endozytischen Vesikeln in das Zytoplasma entweichen kann, um die RNA-Interferenzmaschinerie zu erreichen.
Weiter nach intravenöser Injektion einer Einzeldosis Polyethyleneimin SPION siRNA Nanopartikelkomplexe flozentrimetrische Analysen von CD11b-positiven und CD3-positiven Zellen zeigen eine effizientere Aufnahme der Nanopartikel durch CD11b, die Makrophagen exallert als durch CD3-positive Zellen zu einem beliebigen Zeitpunkt in allen untersuchten Organen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Polyethyleneimin-SPIONs mit einem durchschnittlichen Datenpotenzial von nicht mehr als 37 Millivolt vorzubereiten und die Polyethyleneimin-SPION siRNA-Komplexe auf die niedrigen Eisen-SiRNA-Verhältnisse vorzubereiten. Diese Technik vergleicht die Notwendigkeit für Forscher, das therapeutische Potenzial der Ausrichtung auf Makrophagen in Tiermotoren menschlicher Krankheiten wie und Krebs zu erforschen.
