Dieses immunhistochemische und histopathologische Protokoll kann verwendet werden, um Folatrezeptor Beta zu untersuchen, das ein Kandidatenprotein mit potenziellem prognostischen und therapeutischen Wert für die vaskuläre Mikroumgebung bei Riesenzellarteritis ist. Dieses Protokoll ist bewährt und weit verbreitet und kann verwendet werden, um die Folatrezeptor-Beta-Attribute in zeitlichen Arteriengeweben zu erforschen, auch nach langzeitlagerung. Um Gewebeabschnitte zu erhalten, verwenden Sie ein Mikrotome, um vier bis fünf Mikrometer dicke Abschnitte von paraffineingebetteten temporalen Arterien zu schneiden, die jeden Abschnitt in einem 40 Grad Celsius Wasserbad schweben, wie sie erhalten werden, um Falten zu entfernen.
Verwenden Sie Glasmikroskop-Dias, um drei Abschnitte pro Rutsche zu erfassen, und wärmen Sie die Dias auf einer wärmenden Platte, in einem 60-Grad-Celsius-Ofen für 60 Minuten. Wenn die Abschnitte an den Dias kleben haben, legen Sie die Dias in ein vertikales Rack zum Trocknen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Übertragen Sie die Dias am nächsten Tag für mindestens 12 Stunden in einen Diabehälter zur Lagerung bei vier Grad Celsius.
Als nächstes gleitet die Last in ein Diaregal und hydratisiert das Gewebe mit zwei fünfminütigen, 100%xylen-Tauchionen und einer absteigenden, fünfminütigen Ethanol-Tauchserie pro Konzentration, mit 10 Sekunden Erregung alle 30 Sekunden. Nach dem 70%Ethanol-Eintauchen die Dias zweimal in doppelt destilliertem Wasser für fünf Minuten abspülen, mit 10 Sekunden Aufrührer alle 30 Sekunden. Für die Antigen-Retrieval, übertragen Sie das Rack in einen Glasbehälter mit 200 Mikroliter 95 Grad Celsius, 10 Millimolar pro Liter Citratpuffer für 30 Minuten.
Lassen Sie die Dias am Ende der Inkubation 20 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie sie fünf Minuten lang mit fließendem Wasser abspülen. Um die endogene Peroxidase-Aktivität zu entfernen, verwenden Sie zunächst einen hydrophoben Marker, um einen Kreis um jede Gewebeprobe zu ziehen, bevor Sie die Proben in 200 Mikroliter 3%Wasserstoffperoxid für 10 Minuten inkubieren, gefolgt von 3 Waschungen in 200 Micolitern Tris-gepufferter Salzlösung, oder TBSS, pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche, tab jede Rutsche sanft, um überschüssigepuffer zu entfernen und fügen Sie 200 Mikroliter des primären Antikörper-Cocktail von Interesse und eine Abdeckung Rutschen zu jeder Rutsche für eine einstündige Inkubation in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur.
Am Ende der Inkubation die Deckelschlüpfer entsorgen und die Dias mit drei zweiminütigen Wäbungen in frischem TBSS spülen. Nach dem Entfernen des überschüssigen Puffers 200 Mikroliter einer geeigneten biotinylierten Sekundärantikörperlösung und einen Deckelschlupf zu jedem Schlitten für eine 45-minütige Inkubation in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur hinzufügen. Nachdem Sie die Deckelbelege verworfen haben, spülen Sie die Dias wie gezeigt mit TBSS ab.
Entfernen Sie alle überschüssigen Puffer. Und beschriften Sie die Abschnitte mit 200 Mikroliter DAB-Substratpuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Dias mit TBSS und fließendem Leitungswasser für 10 Minuten waschen, bevor Sie drei Minuten lang mit Hämatoxylin kontern.
Fügen Sie dann 70 Mikroliter eines geeigneten Montagemediums zu jedem Schlitten hinzu und kippen Sie langsam einen Glasabdeckstreifen auf das Montagemedium, um Blasen zu vermeiden, wenn der Deckelschlupf eingelassen wird. Legen Sie das Dia für die histopathologische Analyse auf die Bühne eines Lichtmikroskops und bewerten Sie die Gefäßarchitektur des ersten Gewebeabschnitts. Quantifizieren Sie dann die Anzahl der Makrophagen relativ zur Anzahl der Lymphozyten pro Abschnitt.
Für die immunhistochemische Analyse untersuchen Sie das Folatrezeptor-Beta-Färbungsmuster auf jedem Gewebeabschnitt und quantifizieren die Anzahl der Folatrezeptor-Beta-positiven, CD68-positiven und CD3-positiven Zellen in 10 zufällig ausgewählten Hochleistungsfeldern pro Abschnitt. Hämatoxylin- und Eosinfärbungen in normalen Proben zeigen eine normale arterielle Anatomie mit Endothelzellen in der Tunika-Intima, glatten Muskelzellen in den Tunika-Medien und einer heterogenen Kollagenmatrix, die Fibroblasten und Feedergefäße namens Vasa vasorum in der Tunika-Adventitia umfasst. Riesenzellarteritis positive zeitliche Arterien zeigen eine mittelschwere bis schwere Entzündung, mit Aggregaten und Makrophagen, oder Histiozyten, Lymphozyten, gelegentlichen Plasmazellen und multinukleierten Riesenzellen.
Luminal Verengung ist auch festgestellt, und begleitet von intimverdickung und eine 90%Störung der internen elastischen Lamina. CD3-positive Lymphozyten und CD68-positive Makrophagen sind auch in allen riesenzellartibilisierenden Proben vorhanden, wobei ähnliche Färbungsmuster in allen Biopsien beobachtet werden. Die Färbung für Folatrezeptor-Beta ist auf Makrophagen und multinukleierte Riesenzellen beschränkt, die bevorzugt auf die Adventitia und medienlokalisieren.
Bemerkenswert ist, dass die Folatrezeptor-Beta etwa 30 % der gesamten Makrophagen ausmachte. Die zeitliche ArterienbiopsieVerarbeitung, Schneiden und Entwachsung erfordern sorgfältige Geschicklichkeit, um nachfolgende Schritte durchzuführen. Die Diainterpretation erfordert die Expertise eines erfahrenen kardiovaskulären Pathologen.
Erinnern Sie die Betrachter daran, kontakt- und Atemschutzvorkehrungen wie Handschuhe und belüftete Kapuzen beim Umgang mit Proben und Reagenzien zu verwenden.
