Diese Arbeit wird von NIH R00 CA160574 (SFB) und durch eine Gemeinschaft der Rutgers Biotechnologie Training Program (SMM) unterstützt.

Dieses Verfahren wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Rutgers, der State University of New Jersey genehmigt. Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt. Wissenschaftler sollten ihre nationalen und institutionellen Tierorganisationen für etablierte und genehmigten Richtlinien konsultieren. Bevor Sie beginnen, bereiten die in Tabelle 1 aufgeführten Lösungen. 1. B-Zell-Isolierung und Aktivierung Euthanize eine Maus mit CO 2, gefolgt durch zervikale Dislokation. Bewegen Sie die Maus, so dass die linke Seite des Körpers ist und sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, bis das Fell ist feucht. Sezieren die Milz und in einem 35-mm-Gewebekulturschale mit 2 ml Waschpuffer. In einer Steril, sanft brechen die Milz in der Gewebekulturschale mit dem flachen Ende einer 5-ml-Spritze. <ol><li> Legen Sie eine 70 um Nylon-Mesh in einen 50ml-Tube und die Milz Probentransfer in 2 ml Waschpuffer in die Nylon-Mesh. Stören Sie vorsichtig die Milz in die Maschen mit dem flachen Ende der Spritze. </li><li> Spülen Sie die Rückseite der Spritze und die 35 mm-Platte mit 8 ml Waschpuffer und filtern durch die 70 um Nylon-Mesh. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Absaugen und den Überstand verwerfen und das Pellet in 3 ml ACK-Lysepuffer. Pipette auf und ab kurz, um Klumpen zu stören und Inkubation für 5 min. 10 ml Waschpuffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Absaugen und den Überstand verwerfen und das Pellet durch Antippen der Boden der Röhre dann durch Pipettieren in 1 ml Waschpuffer. Fügen Sie 50 ul von anti-CD43 MACS-Mikroperlen und Inkubation auf Eis für 30 min. 10 ml Waschpuffer, vorsichtig mischen und zentrifugieren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C. 10 ml Waschpuffer, vorsichtig mischen und zentrifugieren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Richten Sie einMini-MACS-Säule, indem Sie eine Spalte auf der MACS-Magnet. Positionieren Sie eine markierte 15 ml konischen Röhrchen unter der Spalte. 1 ml Waschpuffer, um Spalte und zu ermöglichen, durch den 15-ml-Tube laufen. </li><li> Aspiration des Überstands und Resuspendieren in 1 ml Waschpuffer. Legen Sie die Probe in der Spalte nach der Waschpuffer durchgelaufen ist. </li><li> Nachdem die Probe durch die Säule laufen, 1 ml Waschpuffer, um die Säule zu waschen. 7 ml Waschpuffer direkt mit der gesammelten Probe in 15 ml Röhrchen. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Übertragen Sie das erforderliche Volumen der Zellen, die für 5.000.000 Zellen benötigt / Well in einer 50 ml Tube. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Supplement B-Zell-Medium mit LPS 1: 500 und IL4 1: 1.000. </li><li> Saugen Sie den Überstand und die erforderliche Menge von B-Zell-Medium ergänzt für die endgültige Konzentration von 1.000.000 Zellen / ml benötigt. </li><li> Plattenzellen in 6-well-Platten mit 5 ml Zellen bei 1.000.000 Zellen / ml und in einer humidifiED Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2. B-Zell-Fixierung <ol><li> Dann werden 50 ul Colcemid in die Vertiefung, die 5 ml von B-Zellen (bei einer Endkonzentration von 100 ng / ml) und Inkubation 1 h bei 37 ° C aufweist. Vorwärmen 75 mM KCl-Lösung in einem 37 ° C Wasserbad. Übertragen Sie die B-Zellen mit einer markierten 15-ml-Tube. Decken das Etikett mit Band und Zentrifuge bei 300 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie den Überstand, wobei 1 ml in die Röhre und das Pellet durch Pipettieren. 5 ml des vorgewärmten KCl Tropfen für Tropfen, während die Erschließung oder pulsierend auf einem Vortex. </li><li> 10 ml KCl und mischen durch Invertieren. Inkubieren in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. 5 Tropfen frischen Fixiermittel und Mischung durch Umdrehen. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Saugen Sie den Überstand, wobei 1 ml in der Tube und Pellet erneut durch Pipettieren von oben und unten. </li><li> 5 ml frischem Fixativ tropfen beim Tippen oder pulsierend auf einem VORtex. Fügen Sie eine zusätzliche 10 ml Fixiermittel und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Saugen Sie den Überstand, wobei 1 ml in Rohr und resuspendieren durch Pipettieren. Hinzufügen 14 ml frisches Fixiermittel und Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.7 noch zweimal. </li><li> Fügen Sie 14 ml frischem Fixativ. Verschließen Sie die Kappen mit Parafilm und über Nacht bei -20 ° C. </li></ol> 3. Vorbereitung der Metaphasechromosom Spreads <ol><li> Stellen Sie eine geregelte Klimakammer auf 22,9 ° C und 52% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Zentrifuge die Fest B-Zellen bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Absaugen lassen Fixativ 70 ul in der Röhre und resuspendieren durch Pipettieren. </li><li> Zeigen markierten Folien in der Feuchtkammer bei 35 ° Winkel. Fallen 35 ul der resuspendierten B-Zellen auf einem Objektträger und legen zwei Folien pro Probe. Die Objektträger in der feuchten Kammer für 30 Minuten trocknen dann speichern Sie die Folienin einer Dia-Box bei 37 ° C aufweist. </li></ol> 4. Telomere PNA FISH <ol><li> Vorbereitung der Probe <ol><li> Vorwärmen entionisiertem Formamid bis 37 ° C beträgt. Mix 2 ul Telomer PNA-Sonde mit 7 ul entionisiertem Formamid vorgewärmt und bei 37 ° C unter Schütteln für 1 Stunde. </li><li> Pre-Master-Mix warmen FISH auf 37 ° C. Hinzufügen 7 ul vorgewärmt FISH Master-Mix auf die Mischung aus Schritt 4.1.1 und bei 37 ° C für 1-3 Stunden. </li><li> Denaturierung der Sonde Gemisch 8 min bei 80 ° C aufweist. Pre-Annealing der Sonde für 1 Stunde bei 37 ° C aufweist. </li></ol></li><li> Vorbehandlung der Chromosomen Slides <ol><li> Pre-wärmen einen Objektträger aus Glas-Küvette mit 50 ml 0,01 M HCl auf 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Die Objektträger in einem anderen Glasträger-Färbung Gefäß mit 2x SSC für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Add 2 ul Pepsin Lager an die vorgewärmten Objektträger aus Glas-Küvette und mischen durch Invertieren. Die Objektträger in diesem Glas slide-Küvette und Inkubation 90 Sekunden bei 37 ° C. </li><li> Waschen Sie die Slides 2x in einer anderen Glasträger-Küvette aus 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur unter Schütteln. Dann waschen Sie die Folien für 5 min in 1x PBS / MgCl 2 bei Raumtemperatur, Zittern. </li><li> Die Objektträger in einem Glasobjektträger-Küvette mit frisch zubereiteten 1% Formaldehyd / 1x PBS / MgCl 2 für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Folien für 5 min in einem anderen Glasträger-Küvette aus 1x PBS bei Raumtemperatur unter Schütteln. </li><li> Bereiten Sie eine Ethanol-Dehydratisierung Serie von mit getrennten Glasobjektträger-Küvetten mit 70%, 90% und 100% Ethanol. </li><li> Die Objektträger in jedes Glas für 3 min, beginnend mit 70% Ethanol, 90% Ethanol, dann, und dann 100% Ethanol. Zeigen Ethanol Gläser bei -20 ° C, wenn Sie fertig. </li><li> Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen, indem überschüssige Ethanol auf ein Papiertuch und stützte Objektträger bei 35 ° Winkel. Einmal trocken, mark ein 18 x 18 mm-Bereich für eine Hybridisierung an der Rückseite der Führungen mit einem Diamantstift. </li></ol></li><li> Denaturierung der Objektträger für FISH <ol><li> Gelten 120 ul 70% deionisiertem Formamid / 2X SSC zu einem 24 x 60 mm Deckglas. Tippen Sie auf die Folie, um das Deckglas. Denaturieren die Folie bei 80 ° C auf einer Heizplatte für 90 Sekunden. </li><li> Schnell und vorsichtig aus dem Deckglas und legen Sie die Folie in eiskaltem 70% Ethanol für 3 min, gefolgt von 90% Ethanol und 100% Ethanol jeweils für 3 min. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen. </li><li> Bereiten Sie eine feuchte Kammer von Futter eine Kunststoff-Box mit einem dichten Deckel und nasse Seidenpapier. Das Papier sollte feucht sein, aber nicht mit Wasser gesättigt ist. </li><li> In einer feuchten Kammer, gelten die vorgeglüht Sonden-Mix aus Schritt 4.1.3 markierten Bereich auf der Folie, Deckel mit einem 18 x 18 mm Deckglas und bei 37 ° C für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Post-Inkubation Waschanlagen <ol><li> Pre-warmen 50% Formamid / 2x SSC, 1x SSC, und 4x SSC / 0,1% Tween-20 in einem 45 °; C Wasserbad. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser und waschen Sie die Folien in vorgewärmten 50% Formamid / 2x SSC 3xfor jeweils 5 min im Dunkeln und Schütteln. Jedem Wasch die Folien in vorgewärmten 1x SSC 3xfor 5 min Schütteln. Schließlich, waschen Sie die Folien in vorgewärmten 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor jeweils 5 min. </li><li> Färben die Folien für 3 min in DAPI in einem lichtgeschützten Glasobjektträger-Küvette. </li><li> Für 5 min in 2x SSC waschen Sie die Dias, schüttelnd. Bewerben 35 ul Mowiol Mounting Medium, Deckel mit 24 x 60 mm Deckgläser und Objektträger bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Die mikroskopische Analyse der Chromosomen <ol><li> Analysieren Sie die Metaphase Dias mit einem Standard-Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop. Verwenden Sie ein Imaging-Plattform mit einem automatisierten Stufe wie die MetaSystems Metafer Plattform, um die besten Ergebnisse zu erhalten. Für jeden Metaphasespreitung ein Bild für das Fluoreszenzsignal von der Telomer-p, sammeln ein Bild für DAPI-Fluoreszenz zu Chromosomen sichtbar zu machen, undRobe. (ZB sind Cy3 andere Fluorophore verfügbar und arbeiten gleich gut.) </li><li> Überlagern die Bilder mit einem Bildanalyse-Programm und zu analysieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen.

Wohingegen aktivierte B-Lymphozyten sind besonders zur Herstellung von mitotischen Chromosomen-Spreads geeignet, können andere Zelltypen verwendet werden. T-Lymphozyten zu teilen viele der Vorteile von B-Zellen, wie sie aus der Milz oder den Lymphknoten gereinigt werden, und haben einen hohen mitotischen Index, wenn durch das Wachstum in Medium mit geeigneter Mitogene 8 stimuliert. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind auch für Metaphasechromosom Analyse 9 geeignet. Wenn diese nicht vorhanden s...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Krebs wird durch die Akkumulation von Mutationen, die Gene, die die normale Zellwachstum regulieren verursacht. Mutation ist eine Folge von Änderungen in der Struktur und Sequenz des Genoms von DNA-Schäden verursacht. DNA-Schädigungen können durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich exogener Agenzien wie ionisierende Strahlung auftritt, und als ein Nebenprodukt des normalen Zellstoffwechsels, wie zum Beispiel spontane Desaminierung von Nukleotidbasen oder Beschädigung durch Kontakt mit reaktiven Sauerstoffspezies 1 auftritt. Obwohl Säugetierzellen besitzen eine Reihe von Aktivitäten, die Reparatur von DNA-Schäden rückgängig zu machen oder wiederherzustellen die Reihenfolge Bruchstellen können Mutationen dennoch während der gesamten Lebensdauer einer Zelle akkumulieren. DNA-Schädigungen können ferner dazu beitragen, Seneszenz und Verlust der Potenz von Stammzellen, zwei Verfahren, die mit dem Altern verbundene Erkrankung 2 zugeordnet sind. Das Verständnis der Reparatur von DNA-Schäden ist daher von zentraler Bedeutung bei der Bewältigung zwei Zeichenificant in der öffentlichen Gesundheit. Zunehmende Hinweise darauf, dass Säugetier-DNA Reparaturwege können auf die Entwicklung der Krebszellgenom 3,4 beitragen, so dass es umso wichtiger, die Prozesse bei der Unterdrückung Mutation auf molekularer Ebene zu verstehen. Direkte Visualisierung von Chromosomenaberrationen ist ein leistungsfähiges und quantitative mittels Bestimmung des Ausmaßes der genomische Instabilität in einem bestimmten Zelltyp. Kondensierte Chromosomen von Zellen in der Metaphase kann isoliert und untersucht unter Verwendung von Licht oder Fluoreszenzmikroskopie. Solche zytogenetische Ansätze wurden in der Praxis seit Jahrzehnten und kann verwendet werden, um das Auftreten von Translokationen oder spezifische Typen von Chromosomenaberrationen unter Verlust von DNA-Reparatur-Aktivitäten assoziiert nachzuweisen. Das Protokoll eignet sich für mehrere potenzielle Erweiterungen: Chromosomen können mit Sonden zur spektralen Karyotypisierung (SKY) oder mehrfarbige Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung gekennzeichnet werden(MFISH) für die Umsiedlung 5,6 identifizieren. Diese Techniken ermöglichen auch die Häufigkeit der Chromosomentranslokationen und die Struktur komplexer Chromosomentranslokationen zu bestimmen, die über das mit diesem Protokoll ist es möglich zusätzliche Informationen bietet. Alternativ können sequenzspezifische Sonden erzeugt und verwendet, um die Häufigkeit von DNA-Bruch an ausgewählten Standorten genomischen 7 getestet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir Herstellung von Metaphasen-Chromosomen-Spreads von B-Lymphozyten. Ein fluoreszenzmarkierten Peptid-Nukleinsäure (PNA) Sonde für Telomerabschnitten verwendet wird, die wirksam markiert Telomere in Metaphase-Chromosomen verteilt Dieses Protokoll hat mehrere Vorteile. B-Zellen induziert werden kann, um bei hohen Mitoseindex wachsen, so dass hochwertige Spreads konsistent hergestellt werden. B-Zellen von genetisch veränderten Mäusen sind auch viel weniger wahrscheinlich, dass sekundäre genetische Mutationen, die die Analyse des Beitrags verwechseln können, enthaltenspezifischer Gene zu genomischen Integrität. Die PNA-FISH-Ansatz kann in einem Tag abgeschlossen werden, und ermöglicht eine genauere Wertung der Chromosomenbrüche. Durch die Nutzung dieser Ansatz, insbesondere in Kombination mit in diesem Protokoll beschriebenen spezifischen Geräten ist es möglich, sehr konsequent, hochwertige Brotaufstriche produzieren und schnell analysieren die Geschwindigkeit und Art der genomische Instabilität.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

Defekten DNA-Reparatur zu genomischer Instabilität, die die Ursache für Mutationen, die zu Tumorentstehung führen wird erhöht. Analyse der Häufigkeit und Art der Chromosomenaberrationen in verschiedenen Zelltypen ermöglicht Defekte in DNA-Reparaturwege aufgeklärt werden. Verständnis Säugetierbiologie DNA-Reparatur hat sich stark durch die Produktion von Mäusen mit Knockouts in bestimmten Genen geholfen. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität in Maus-B-Lymphozyten zu quantifizieren. Kennzeichnung der Telomere mit PNA-FISH-Sonden (Peptid-Nukleinsäure - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) ermöglicht die schnelle Analyse von genomischen Instabilität in Metaphasechromosom Spreads. B-Zellen haben spezifische Vorteile gegenüber Fibroblasten, weil sie normale Ploidie und eine höhere mitotische Index haben. Kurzzeitkultur von B-Zellen ermöglicht daher eine genaue Messung der genomischen Instabilität in einer primären Zellpopulation, die voraussichtlich weniger Neben genetische Mutation ists als das, was in der Regel in transformierten Fibroblasten oder Patientenzelllinien gefunden.

Metaphase-Chromosomen aus einer Zelle stamm eine diskrete Cluster, die 40 Chromosomen (bei ​​Verwendung von Mauszellen) (1A) zu bilden. Jedes Chromosom hat einen Zentromer an einem Ende, die als Licht blaue Kugel sichtbar ist. Im normalen Chromosomen sind zwei Telomer Signale am Ende der Chromatiden und zwei Signale, die von jedem Romer gesehen. Interphase-Kernen auf der Folie zugegen sein. Diese werden als blaue Kugeln, mit rotem Telomer-Signale, aber keine kondensierten Chromosomen (siehe zum Beis...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

DNA-Reparaturwege sind wichtig für die Erhaltung der genomischen Integrität und Mutation verhindert und Krebs. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität durch direkte Beobachtung von Chromosomenaberrationen in Metaphase-Spreads Quantifizierung von Maus-B-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) für Telomer-DNA-Wiederholungen.

Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

rapid-analysis-chromosome-aberrations-mouse-b-lymphocytes-pna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Aufrufe.  Rutgers, the State University of New Jersey.  DNA-Reparaturwege sind wichtig für die Erhaltung der genomischen Integrität und Mutation verhindert und Krebs. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität durch direkte Beobachtung von Chromosomenaberrationen in Metaphase-Spreads Quantifizierung von Maus-B-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) für Telomer-DNA-Wiederholungen. 

Serie: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many proteins. Classic imaging techniques have been used to study these phenomena. However, they required the manual acquisition of many cells followed by time consuming quantification of the morphology and the co-localization of the staining of tens of cells. Here, a rapid and powerful method is described to study these phenomena on samples consisting of several thousands of cells using an imaging flow cytometry technology that combines the advantages of a microscope with those of a cytometer. Using T lymphocytes stimulated with CCL19 and staining for MHC Class I molecules and filamentous actin, a gating strategy is presented to measure simultaneously the degree of shape alterations and the extent of co-localization of markers that are affected by CCL19 signaling. Moreover, this gating strategy allowed us to observe the segregation of filamentous actin (at the front) and phosphorylated Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) proteins (at the rear) in polarized T cells after CXCL12 stimulation. This technique was also useful to observe the blocking effect on polarization of two different elements: inhibition of actin polymerization by a pharmacological inhibitor and expression of mutants of the Par6/atypical PKC signaling pathway. Thus, evidence is shown that this technique is useful to analyze both morphological alterations and protein redistributions.

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Schnelle und robuste Analyse Zelluläre und Molekulare Polarisation durch Chemokine Signaling Induced

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Schnelle molekulare Erkennung und Differenzierung von Influenza-Viren A und B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...