Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Wirts-Pathogen-Interaktionsfeld wie die Pathogenität und Virulenz einer bakteriellen Infektion zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir die Toxizität zwischen und innerhalb von Aeromonas Arten bewerten und zu unserem Verständnis der Pathogenese der Aeromonas-Infektion beitragen können. Um zu beginnen, etwa 2.000 gravid erwachsene Würmer mit sterilem entionisiertem Wasser zu waschen.
Wiederholen Sie die Wäsche dreimal, um die Würmer an der Unterseite des Rohres zu halten. Nach dem Zentrieren entfernen die Würmer den Überstand und halten die Würmer in 3,5 Milliliter entionisiertem Wasser. Fügen Sie einen Milliliter Natriumhypochlorit und 0,5 Milliliter Kaliumhydroxid in die Röhre.
Dann schütteln Sie das Rohr für sechs Minuten, um die Wurmkörper zu lysieren. Nachdem die Eier freigegeben wurden, fügen Sie 10 Milliliter entionisiertes Wasser hinzu, um die Lyse zu stoppen. Dann zentrifugieren Sie das Rohr, um die Eier nach unten zu ziehen und so viel vom Überstand wie möglich zu entfernen.
Waschen Sie die Eier mit 15 Milliliter M9 Medium mindestens dreimal. Die Eier auf ein 3,5-Zentimeter-Gericht übertragen und bei 20 Grad Celsius für eine Nacht bebrüten. Danach entfernen Sie 10 Mikroliter L1-Würmer und M9-Medium von der Platte.
Zählen Sie die Würmer und erhalten Sie die Konzentration von L1-Würmern im M9-Medium. Mit einer Pipette nehmen Sie 0,5 Milliliter E.coli OP50 LB Brühe und verteilen Sie sie auf einer ENGM-Platte. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 16 bis 18 Stunden.
Kühlen Sie die ENGM auf Raumtemperatur. Dann Samen inkubierte L1-Würmer auf einer ENGM-Platte mit E.coli OP50. Die Würmer bei 20 Grad Celsius bebrüten, bis sie die L4-Stufe erreichen.
Wählen Sie zunächst eine einzelne Kolonie jeder der vier Aeromonas-Stämme aus und bemalen sie entsprechend dem Textprotokoll. Messen Sie dann die OD 600 Absorption der bakteriellen Brühe und passen Sie sie an, bis die Absorption gleich 2,0 ist. Nächster Punkt und 30 Mikroliter bakterielle Brühe von jedem Stamm in NGM-Platten verteilen.
Wählen Sie zufällig die zuvor vorbereiteten L4-Würmer aus und übertragen Sie sie mit den Aeromonas-Stämmen auf die NGM-Platten. Dann inkubieren Sie die Platten bei 20 Grad Celsius, bis der Test abgeschlossen ist. Übertragen Sie jeden Tag alle lebenden Würmer auf eine neue NGM-Platte mit Bakterien.
Zähle die Anzahl der lebenden, toten und Sensorwürmer jeden Tag, bis der letzte Wurm tot ist. Nach der Kultivierung der Aeromonas-Stämme und der Messung ihrer Absorptionsfähigkeit, wie zuvor beschrieben, zentrieren Sie die bakterielle Brühe bei 3, 500 g für 15 Minuten. Stellen Sie die bakterielle Brühe mit S Medium ein.
Und fügen Sie 195 Mikroliter bakterielle Brühe in die S-Mittel bis acht Brunnen einer 96-Well-Platte. Die Würmer von der ENGM-Platte mit m9 medium abwaschen. Passen Sie dann die Konzentration der Wurmlösung auf fünf Würmer pro Mikroliter an.
Fügen Sie fünf Mikroliter der Wurmlösung zu jedem der Brunnen der 96-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Platte auf einem Shaker, und zählen Sie die Anzahl der lebenden Würmer bei 24, 48 und 72 Stunden. Nach der Kultivierung von Aeromonas-Stämmen und der Anpassung der Absorption gemäß dem Textprotokollspot und der Ausbreitung der Bakterienbrühe auf NGM-Platten.
Danach 50 L4-Würmer auf jede NGM-Platte übertragen. Alle 24 Stunden die Würmer auf frische NGM-Platten übertragen. Wählen Sie zufällig 10 Würmer aus und übertragen Sie sie auf ein 2%Agarose-Gel in M9-Medium auf einer Folie.
Positionieren Sie schließlich einen Coverslip auf dem Gel und erfassen Sie Muskelbilder mit einem grünen fluoreszierenden Proteinfilter auf einem fluoreszierenden Mikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist. In diesem Protokoll wurden die Toxizitäten von vier Aeromonas-Stämmen bewertet. Die Überlebensrate von C.elegans, die mit Aeromonas-Arten infiziert waren, war am höchsten in Assays mit A.caviae und am niedrigsten bei Assays mit A.dhakensis.
In einem flüssigen Toxizitätstest verringerte sich das Überleben von C.elegans signifikant, wenn es mit A.dhakensis oder A.hydrophilia infiziert wurde. In der Muskelnekrose Assay Grade der Muskelschäden variierten zwischen den Aeromonas Arten. A.caviae verursachte die wenigsten Muskelschäden, während A.dhakensis die meisten Muskelschäden produzierte.
Die in diesem Video beschriebenen Methoden bieten eine bequeme Möglichkeit, die Virulenzvielfalt zwischen und innerhalb der Aeromonas-Arten zu unterscheiden. Darüber hinaus ist es auch ein zuverlässiges Modell, um die Wechselwirkung zwischen einem Erreger und wirt zu studieren.
