Dieses Protokoll nutzt alle wichtigen Funktionen von AFM, nicht zugänglich für andere Einzelmolekül-Techniken. Dadurch sind wir in der Lage, die Struktur des Nukleosoms im Nanomaßstab zu lösen. Wichtig ist, dass die direkte Visualisierung von Nukleosomen unter physiologischen Bedingungen durchgeführt wurde.
Mit unserer AFM-Technik haben wir vor kurzem einzigartige Eigenschaften des Zentromosonats entdeckt, die eine Rolle auf der Funktion des gesamten Zentrimerosen spielen können. Die zu zeigende Methode wird derzeit in unserem Labor angewendet, um die Selbstmontage von Proteinen zu untersuchen, die mit der Bildung von Amyloid-Aggregaten verbunden sind. Diese Proteinaggregate lösen die Entwicklung von verheerenden Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson aus, um nur einige zu nennen.
Die einfachen Zubereitungsmethoden sind auch auf andere Protein-DNA-Komplexe anwendbar, einschließlich großer Systeme wie DNA-Replikationsmaschinen. Obwohl einige Änderungen erforderlich sind. Um Nukleosomenpartikel auf Einzelmolekülebene mittels statischer und zeitrafferischer Atomkraftmikroskopie zu charakterisieren, beginnen Sie mit der Reinigung, Montage und Validierung der Nukleosomen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.
Als Nächstes bereiten Sie die Glimmeroberfläche für die statische AFM-Bildgebung vor. Um dies zu tun, bereiten Sie zunächst eine fünfzig Millimolar APS-Lagerlösung in entionisiertem Wasser vor. Lagern Sie einen Milliliter Aliquots dieser Lösung bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt wird.
Aus der Lagerlösung eine funktionierende APS-Lösung für die Glimmermodifikation vorzubereiten, indem Sie 50 Mikroliter des 50 Mikromolaren APS-Bestands in 15 Milliliter destilliertem deionisiertem Wasser auflösen. Mischen Sie die Lösung und füllen Sie dann eine Küvette mit der Lösung. Als nächstes schneiden Sie einen mal drei Zentimeter Streifen Glimmer aus hochwertigen Glimmerplatten.
Prüfen Sie, ob das Stück diagonal in eine Küvette passt. Dann spalten Schichten des Glimmers, bis beide Seiten frisch gespaltet sind, und das Stück ist so dünn wie 0,1 Millimeter. Legen Sie das Glimmerstück sofort in die APS-gefüllte Küvette und inkubieren Sie den Glimmer 30 Minuten lang.
Das Glimmerstück auf eine mit destilliertem deionisiertem Wasser gefüllte Küvette übertragen und 30 Sekunden einweichen. Verwenden Sie dann Argon, um beide Seiten des APS-Glimmerstreifens vollständig zu trocknen. Tragen Sie doppelt Gesicht Klebeband auf mehrere magnetische Pucks und legen Sie sie auf die Seite.
Dann schneiden Sie das APS-Glimmersubstrat auf einen Zentimeter um einen Zentimeter Quadrate und bedecken Sie es mit einer sauberen Petrischale. Als nächstes bereiten Sie drei Verdünnungen der zusammengesetzten Nukleosomen mit einem 0,22 Mikrometer gefilterten Puffer vor, der 10 Millimolarhepes und vier Millimolar-Magnesiumchlorid mit einem PH von 7,5 enthält. Um den Verlust von Nukleosomen bei der geringen Endkonzentration zu begrenzen, sollte die Verdünnung unmittelbar vor der Ablagerung auf dem APS-Glimmer nacheinander erfolgen.
Legen Sie fünf bis zehn Mikroliter jeder Nukleosomprobe in der Mitte eines APS-Glimmerstücks ab und lassen Sie sie zwei Minuten lang brüten. Dann spülen Sie die Probe vorsichtig mit zwei bis drei Milliliterdem destilliertem entionisiertem Wasser ab, um die Pufferkomponenten zu entfernen. Und trocknen Sie die abgelagerte Probe unter einem leichten Fluss von Argon.
Um zu beginnen, montieren Sie eine Spitze auf dem Spitzenhalter des AFM-Setups. Montieren Sie dann die erste Probe auf der AFM-Stufe, wobei Sie darauf achten, nicht mit der Probenoberfläche in Kontakt zu treten. Positionieren Sie den Laser über dem Ausleger, bis seine Summe am Maximum liegt, und stellen Sie die vertikalen und seitlichen Umlenkwerte auf nahe Null ein.
Stimmen Sie dann die AFM-Sonde so ab, dass sie ihre Resonanzfrequenz findet, passen Sie die Antriebsamplitude an und stellen Sie die Bildgröße auf 100 mal 100 Nanometer ein. Nachdem Sie die Einrichtung vorgenommen haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Einbinden", um den Ansatz zu beginnen. Wenn der Ansatz abgeschlossen ist, optimieren Sie schrittweise den Amplituden-Sollwert, bis die Oberfläche der Probe klar sichtbar ist.
Erhöhen Sie dann die Scangröße um einen Mikron auf ein Mikron und die Auflösung auf 512 x 512 Pixel. Klicken Sie schließlich auf die Aufnahmeschaltfläche, um mit der Bildaufnahme zu beginnen. Verwenden Sie Glasstabscannerkleber, um eine Glasstange an der AFM-Scannerstufe zu befestigen.
Lassen Sie dies für mindestens 10 Minuten trocknen. In der Zwischenzeit 0,1 Millimeter dicke kreisförmige Glimmerstücke mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern herstellen, indem man sie aus einem größeren Glimmerblech stanzt. Verwenden Sie den Hochgeschwindigkeits-AFM Glimmer-Glasstabkleber, um dieses Glimmerstück an der Glasstange des Hochgeschwindigkeits-AFM zu befestigen und es mindestens 10 Minuten lang unberührt zu lassen, während es trocknet.
Dann spalten Sie Schichten aus dem Glimmer mit einem druckempfindlichen Band, bis eine gut gespaltete Schicht auf dem Band zu sehen ist. Als nächstes verdünnen Sie einen Mikroliter 50 Millimolar APS Lager in 99 Mikroliter destilliertem deionisiertem Wasser, um eine 500 Mikromolar APS Lösung zu machen. 2,5 Mikroliter der Lösung auf die frisch gespaltete Glimmeroberfläche ablagern und die Oberfläche 30 Minuten funktionalisieren lassen.
Nach der Inkubation spülen Sie den Glimmer mehrmals mit destilliertem entionisiertem Wasser, indem Sie drei Mikroliter Spülungen auftragen. Entfernen Sie das Wasser nach jeder Spülung vollständig, indem Sie ein Vliesamperam am Rand des Glimmers platzieren. Legen Sie nach der endgültigen Spülung drei Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser auf die Oberfläche und lassen Sie es mindestens fünf Minuten sitzen, um alle nicht spezifisch gebundenen APS zu entfernen.
Als nächstes legen Sie die Sonde in den Hochgeschwindigkeits-AFM-Halter und positionieren Sie den Halter auf der AFM-Bühne mit der Spitze nach oben. Spülen Sie den Halter mit 100 Mikroliter destilliertem entionisiertem Wasser, gefolgt von zwei 100-Mikroliter-Spülungen mit 0,22 Mikron gefiltertem Nukleosom-Bildgebungspuffer. Mit den Spülungen, füllen Sie die Kammer mit 100 Mikroliter Nukleosom Bildgebung Puffer, untertauchen die Spitze.
Passen Sie die Auslegerposition an, bis sie mit dem Laser getroffen wird. Spülen Sie dann die APS Glimmer fünfmal mit gefiltertem Nukleosom-Bildgebungspuffer mit vier Mikrolitern pro Spülung. Verdünnen Sie einen Mikroliter des Nukleosom-Montagebestands in 250 Mikroliter gefilterten Nukleosom-Bildgebungspuffers für eine endgültige Nukleosomenkonzentration von einem Nanomolar.
2,5 Mikroliter dieser Verdünnung auf die Oberfläche legen und zwei Minuten sitzen lassen. Spülen Sie die Oberfläche zweimal mit vier Mikrolitern Nukleosom-Bildgebungspuffer, um über Dassamezuberg zu vermeiden. Lassen Sie nach dem letzten Spülen die Oberfläche mit einem Bildpuffer bedeckt.
Stellen Sie den Scanner und die Probe auf den Spitzenhalter, sodass die Probe verdeckt ist. Um den Ansatz zu beginnen, verwenden Sie die Auto-Anflug-Funktion mit der Sollwertamplitude in der Nähe der freien Schwingungsamplitude. Passen Sie den Sollwert an, bis die Oberfläche gut verfolgt wird.
Legen Sie dann den Bildbereich um 150 mal 150 Nanometer auf 200 mal 200 Nanometer bei der Datenerfassungsrate von etwa 300 Millisekunden pro Bildbildrahmen fest. Als Steuerung für die Montage und Ablagerung wurden H3-Mononukleosomen mit statischem AFM hergestellt und abgebildet. Dieses Bild liefert eine Momentaufnahme der Nukleosompopulation, wie sie momente vor der Ablagerung existierte und bestätigte, dass Nukelosome erfolgreich zusammengesetzt wurden.
Mit dem Erfolg der H3-Kontrollbaugruppe wurden die vorgestellten Methoden als nächstes auf die Untersuchung von CENP-A-Nukleosomen angewendet. Statische AFM-Bildgebung dieser Probe zeigte, dass ihre Montage ein Erfolg war. Aus den statischen AFM-Bildern konnte die Höhe und Wendezahl der Mononukleosomen charakterisiert werden.
Sowohl der Winkel zwischen den freien DNA-Armen als auch die Länge der freien DNA-Arme werden verwendet, um die Anzahl der DNA-Drehungen im einzelnen Nukleosom zu bestimmen. Im Gegensatz dazu kann die Zeitraffer-AFM-Bildgebung der Nukleosomen verwendet werden, um das spontane Entpackverhalten der Nukleosomen zu visualisieren. Wenn die Wendezahl des Nukleosoms abnimmt, wird auch eine entsprechende Abnahme des Nukleosom-Kernvolumens beobachtet.
Zusätzlich zur regelmäßigen Zeitraffer-Bildgebung kann High-Speed-Zeitraffer AFM verwendet werden, um die kompliziertere Nukleosomendynamik zu untersuchen, die mit Der Standardzeitraffer-Bildgebung übersehen wird. Die Fähigkeit dieser Technik, die Dynamik über einen langen Zeitraum zu erfassen, war entscheidend für die Visualisierung einer Ferntranslokation eines CENP-A-Nukleosomkerns, der im Laufe von 1200 Frames erfasst wurde. Diese Technik war auch entscheidend bei der Erfassung des seltenen Transfers eines CENP-A-Nukleosomkerns von einem DNA-Substrat zum anderen.
Die schnelle Bildaufnahmerate ermöglichte die Visualisierung dieses dynamischen Ereignisses, da nur mehrere Frames zu absolvieren waren. Im breiten Chromatinfeld gibt es eine Reihe wichtiger Fragen zu den Rollen von Liger-Histones und der Histonvergrößerung der Chromatindynamik. All diese Fragen können mit unserer Technik beantwortet werden.
