Wir präsentieren ein Protokoll zur elektronenmikroskopischen Visualisierung der replizierenden Domänen in der Zelle durch die EdU-Markierung der neu synthetisierten DNA und Markierungsdetektion mit Silberverstärkung von Nanogoldpartikeln und ChromEM-Färbung des Chromatins. Dieses Protokoll gibt die kontrastreiche Voreinbettungsmarkierung mit herkömmlicher Glutaraldehydfixierung, die die beste strukturelle Konservierung des Chromatins für die Probenverarbeitung bei Raumtemperatur bietet. Dieses Protokoll ist für die Haftzelle optimiert, die auf den Deckgläsern in der Petrischale wächst.
Fügen Sie EdU zu 10 Mikromol Endkonzentration hinzu und legen Sie die Zellen für die gewünschte Markierungszeit in den Inkubator. Fixieren Sie die markierten Zellen mit 2,5% Gluaradehydrat in einer 100-Millimol-Natriumcacodylatlösung für eine Stunde. Eine längere Fixationszeit kann sich nachteilig auf die EdU-Kennzeichnung auswirken.
Entfernen Sie Glutaraldehyd, indem Sie die Proben mit PBS spülen, das mit fünf Millimol Magnesiumchlorid ergänzt wird, das weiterhin als PBS-Stern angesehen wird. Dreimal für 10 Minuten waschen. Permeabilisieren Sie Plasmamembranen mit 1% Lösung von Trione X-100 in PBS Star, nehmen Sie zwei Änderungen für jeweils fünf Minuten vor.
Diese Lösung wird weiter als PBS star T.Ausführlich die Probe mit PBS star waschen. Fünf Änderungen für jeweils fünf Minuten. Löschen Sie die verbleibenden Aldehydgruppen mit 20 Millimol Glycin in PBS Star, zweimal für 10 Minuten.
Legen Sie die Probe eine halbe Stunde lang mit 1% BSA in PBS star. Bereiten Sie während der Blockierung in BSA den Reaktionscocktail für die EdU-Erkennung vor. Die Reihenfolge der Komponentenaddition ist wichtig.
Die EdU-Biotin-Azid-Konjugation wird in der feuchten Kammer durchgeführt, um die Verdunstung und Konzentrationsverschiebungen im Reaktionscocktail zu minimieren. Bereiten Sie die feuchte Kammer vor. Legen Sie das Deckglas mit einer Zelle nach oben auf den Parafilm und schichten Sie 50 bis 100 Mikroliter des Reaktionscocktails auf das Deckglas.
Die Reaktion dauert bei Raumtemperatur 30 Minuten. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Probe in PBS-Stern T waschen, fünfmal für jeweils fünf Minuten. Blockieren Sie erneut mit 1% BSA in PBS-Stern T für eine weitere halbe Stunde.
Streptavidin-Nanogold-Lösung in PBS star T mit 1%BSA vorbereiten. Inkubieren Sie die Probe mit Streptavidin über Nacht bei plus vier Grad in einer neu vorbereiteten Feuchtkammer. Das Verfahren ist das gleiche wie bei der EdU-Biotin-Azid-Konjugation.
Stoppen Sie die Reaktion und waschen Sie die Probe, fünfmal für jeweils 10 Minuten mit PBS-Stern T.Stabilisieren Sie den Biotin-Streptavidin-Komplex durch zusätzliche Fixierung von 1% Glutaraldehyd PBS-Stern für eine halbe Stunde. Entfernen Sie Glutaraldehyd durch intensives Waschen mit entionisiertem Wasser. Restaldehydgruppen mit einem Milligramm pro Milliliter Natriumborhydrid abschrecken.
Noch einmal gründlich waschen. Der nächste Schritt besteht darin, die Größe von Nanogold-Partikeln durch Silberabscheidung auf dem goldenen Kurs zu erhöhen. Bereiten Sie Premixe vor, um die Aktivität in der Dunkelkammer zu minimieren.
Gleichen Sie die Proben mit dem Waschpuffer aus und begeben Sie sich in eine Dunkelkammer. Mischen Sie in der Dunkelkammer die Komponenten, um die Waschlösung vorzubereiten, und tragen Sie sie auf die Proben auf. Akazienpulverlösung ist hochvisisch.
Während des Mischens der Komponenten schaukeln Sie das Rohr langsam, um Blasen- und Schaumbildung zu vermeiden. Die Reaktion dauert zwei bis fünf Minuten. Wir empfehlen, einen Testlauf durchzuführen, um die optimale Reaktionszeit zu bestimmen.
Eine längere Inkubationszeit kann zu einer unspezifischen Silberabscheidung führen. Um die Reaktion zu stoppen, spülen Sie die Probe schnell mit drei bis fünf Änderungen des deionisierten Wassers ab. Gefolgt von drei weiteren Änderungen für jeweils fünf Minuten.
Um die Silbernanopartikel vor der Auflösung durch das Osmiumtetroxid zu schützen, inkubieren Sie die Proben in 0,05% Tetrachloraurinsäure für zwei Minuten im Dunkeln. Gründlich mit deionisiertem Wasser waschen. In diesem Stadium wird dem DNA-haltigen Material zusätzlicher Kontrast hinzugefügt.
Sättigen Sie die Probe mit DRAQ5-DNA-Färbung. Diamionobenzidinlösung in die Probe geben und eine Minute lang inkubieren. Bewegen Sie das Deckglas in die Petrischale mit Glasboden und legen Sie es auf den Tisch des umgekehrten Mikroskops.
Bestrahlen Sie mehrere Sichtfelder mit 640 Nanometer rotem Licht. Das linke Feld zeigt die komplette Fotobleiche von DRAQ5. Auf der rechten Seite ist das gleiche Sichtfeld im Durchlichtlicht abgebildet, das DAB-Niederschlag zeigt.
Waschen Sie Proben mit deionisiertem Wasser. Die nächste Stufe sollte unter dem Abzug durchgeführt werden. Hergestellt eine teilweise reduzierte Osmiumtetroxidlösung.
Sei vorsichtig. Diese Substanz ist sehr flüchtig und giftig. Tragen Sie die vorbereitete Lösung auf die Probe auf.
In diesem Stadium reagieren die reduzierten Osmiumverbindungen mit Diamionobenzidinablagerungen und erhöhen den Kontrast der DNA. Entsorgen Sie die osmiumhaltige Lösung gemäß Ihren lokalen Vorschriften und waschen Sie die Proben dreimal für jeweils fünf Minuten. Die Probe wird in einer Reihe von steigenden Ethanolkonzentrationen weiter dehydriert, gefolgt von der Infiltration der Zellen mit Ethanolharzmischungen.
Ersetzen Sie die Alkoholharzmischung durch frisch zubereitetes reines Harz. Füllen Sie die richtig dimensionierte Einbettform mit einem frisch zubereiteten Harz. Legen Sie das Deckglas mit einer Zelle nach unten über den mit Harz gefüllten Hohlraum.
Aushärten Sie das Harz für 24 Stunden bei 37 Grad. Dann bei 60 Grad für mindestens zwei Tage. Entfernen Sie Harz von einer Unterseite einer Abdeckung.
Lassen Sie die Platte in einen flüssigen Stickstoff fallen und geben Sie sie dann in kochendes Wasser um. Das Glas sollte sich lösen. Wiederholen Sie dies bei Bedarf.
Bestrahlte Sichtfelder sollten aufgrund der Diamionobenzidinabscheidung und der DAB-Färbung deutlich sichtbar sein. Schneiden Sie den Interessenbereich mit der Bügelsäge oder einem anderen geeigneten Instrument aus der Platte aus. Legen Sie den Ausschnitt in den einfachen Ultramikrotom-Halter.
Richten Sie das Ultramikrotom für das endgültige Blocktrimmen ein. Bereiten Sie mit der Rasierklinge den pyramidenförmigen Pfeiler vor. Die Größe einer flachen Fläche auf der Spitze der Pyramide sollte etwa 400 x 200 Mikrometer betragen.
Montieren Sie die vorbereitete Pyramide in den Ultramikrotomarm und installieren Sie das Messer. Bereiten Sie die Abschnitte vor. Die Profildicke kann an die experimentellen Anforderungen angepasst werden.
Wir streben die EM-Tomographie an. Also haben wir Abschnitte mit einer Dicke von 250 Nanometern vorbereitet, die auch als Halbdünnschnitte bezeichnet werden. Lösen Sie die Abschnitte von der Messerkante und montieren Sie sie auf einem Schlitzgitter.
Wir benutzten ein Schlitzgitter, sie waren rund ein Millimeter, um um herum zu sein, ein Millimeter seitliche Öffnung. Die geringe Öffnungsgröße sorgt für eine bessere Stabilität der Abschnitte. Lassen Sie die Proben auf dem Gitter trocknen.
In diesem Moment sind die Abschnitte bereit für die Beobachtung. Legen Sie das Gitter in den elektronenmikroskopischen Probenhalter. Laden Sie die Probe in das Elektronenmikroskop.
Erwerben Sie die Tilt-Serie. Replikationsherde in Zellkernen von Säugetieren zeigen je nach S-Phasen-Progression unterschiedliche Verteilungsmuster. Erfolgreiche EdU-Markierung, die durch die Klickreaktion mit fluoreszierend markiertem Azid bestätigt wurde, zeigt ein typisches Replikationsmuster in der heterogenen Zellpopulation nach Glutaraldehydfixierung an der Spitze.
Die Streptavidin-Markierung kann durch Glutaraldehyd beeinflusst werden. Überprüfen Sie also zuerst die Fluoreszenz-Streptavidin-Färbung unter den gleichen Bedingungen wie Streptavidin-Nanogold auf dem Boden. Ein gutes Ergebnis des Silberverbesserungsverfahrens ist eine dunkelbraune Färbung einiger Kerne und eine sehr schwache gelbe Cytoplast-Färbung, die auf der Unterseite zu sehen ist.
Vorteil einer Voreinbettungsbeschriftung ist die Möglichkeit, Zellen für den Schnitt auszuwählen. Dies ist in diesem Stadium möglich, da die Markierungsmuster unter einem Hellfeldmikroskop sichtbar werden. Die entsprechende Beschriftung führt zu den gut abgegrenzten Replikationsstandorten.
Pfeilspitzen zeigen die DAB-gefärbten Chromatinfasern. Die Hintergrundbeschriftung auf der rechten Seite ist auf wenige Nanopartikel pro Quadratmikrometer beschränkt. Halbdünne Schnitte sind bereit für die Tomographie und erfordern keine Zugabe von Goldnanopartikeln.
Der beschriebene Ansatz, der für die Studien der Chromatinorganisation an Standorten mit aktivierter Replikation verwendet wird. Zur Analyse der postreplizierten Neuanordnung von Chromatin einschließlich hochauflösender Bildgebung der Chromatinsegregation. Es wurde auch für die replizierte Markierung großer Chromosomendomänen und Studien zur Chromatinfaltung und Heterochromatin höherer Ordnung verwendet.
Diese bildgebende Technik ist auch als Referenzpunkt für die Daten wichtig, die durch andere nicht-mikroskopische Ansätze erzeugt werden. Die Methode kann auch in korrelierte mikroskopische Studien einschließlich Superauflösungstechniken integriert werden. Dies eröffnet neue Horizonte in der Erforschung der Chromatin-Struktur höherer Ordnung und ihrer Dynamik in den verschiedenen physiologischen Zuständen der Zelle.
