Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Candida-Bereich über Stammvirulenz und die Beiträge bestimmter Gene zu diesen Prozessen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie Bedenken in Bezug auf den Einsatz von Tieren vermeidet, robust, schnell, billig ist und eine hohe Anzahl von Tieren pro Experiment bietet. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, wahrscheinlich ein wenig kämpfen, weil sie einige Schwierigkeiten haben werden, die Wurmlebensfähigkeit vor Beginn des Experiments zu beurteilen, oder sie könnten einige Probleme mit der inkonsistenten Injektion der Würmer haben.
Bestellen Sie Larven bei Großhändlern und Lieferanten, die keine Hormone, Antibiotika oder andere Behandlungen in die Larven einführen und in der Lage sind, lebende Exemplare zu versenden und zu liefern. Wenn die Larven ankommen, überprüfen Sie jeden Behälter, um die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Larven zu bestätigen. Gesunde Larven werden vollständig unter der Bettwäsche untergetaucht, bewegen sich und besitzen eine gelbe, leichte Bräune Färbung mit wenigen Larven, die schwarze Flecken oder Verfärbungen entlang des Körpers enthalten.
Die Larven können in ihren Behältern in einem belüfteten Raum bei Umgebungstemperatur bis zu zwei Wochen gelagert werden. Um die Hefezellen auf die Galleria mellonella-Infektion vorzubereiten, wachsen die C.albicans-Stämme, die über Nacht in drei Milliliter frischer Hefe-Pepton-Dextrose-Brühe pro Sorte in Standardkulturröhren auf einer rotierenden Trommel bei mittlerer Geschwindigkeit und 30 Grad Celsius injiziert werden. Am nächsten Morgen sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie die Hefe dreimal in fünf Milliliter nfrischem PBS pro Zentrifugation.
Nach der letzten Wäsche die Zellen in einem Milliliter frischer PBS wieder aufsetzen und die Hefe in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Die Zellen in zusätzlichen PBS bei eins zu 100, eins zu 1, 000 und einbis100 000 Konzentrationen verdünnen und die Zellen aus den Eins-zu-100- und Eins-zu-1-Verdünnungen zählen. Passen Sie die Zellen auf 2,5 mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter PBS-Konzentration in einem neuen Mikrozentrifugenrohr an und bestätigen Sie die Genauigkeit der infektiösen Dosis, indem Sie das entsprechende Volumen der Eins-zu-100-Verdünnung verschichten, um 100 koloniebildende Einheiten auf einer Hefe-Pepton-Dextrose-Agarplatte für jede Kultur zu erhalten, die bei einer Infektion verwendet werden soll.
Um die Larven mit den Candida-Zellen zu infizieren, verteilen Sie zunächst eine kleine Menge Wachswurmeinstreu in eine leere, 100 mal 15 Zentimeter sterile Petrischale pro biologischer Replikation und sterilisieren Sie eine 10-Mikroliter-Spritze, die dreimal mit einer 26-Spur-Nadel mit 10 Mikrolitern 70%Ethanol und dreimal mit 10 MikroliterPBS pro Waschgang ausgestattet ist. Als nächstes wirbeln Sie die Inokulationsverdünnung von C.albicans aus und laden Sie 10 Mikroliter Zellen in die Spritze. Öffnen Sie einen Behälter mit G.mellonella Larven, und verwenden Sie einen Finger, um vorsichtig die Bettwäsche umzudrehen, um Larven aufzudecken, indem Sie gelbe, tan Larven ähnlicher Größe auswählen, die in guter Gesundheit sind und einen Mangel an schwarzer Pigmentierung auf den Körpern haben, indem Sie die Mittel- und Zeigefinger und den Daumen verwenden, um eine Larve in einer Weise aufzunehmen, die dem Greifen eines Bleistifts ähnelt.
Rollen Sie die Larve auf den Rücken, so dass die Beine nach oben zeigen und die gesamte Länge des Körpers zwischen den Fingern und dem Daumen halten, so dass die Larve nicht in der Lage ist, sich zu krümmen oder von der Injektion wegzuziehen. Mit der anderen Hand drehen Sie die Spritze so, dass die Nadelabschrägung nach oben gerichtet ist, und legen Sie langsam die gesamte Länge der Abschrägung in den Körper an der Kreuzung mit dem hintersten linken Bein ein, um sicherzustellen, dass die Nadel in den Körper eindringt und nicht einfach den Körper der Larve nach innen drückt. Der kritischste Schritt in diesem Verfahren ist die Injektion des Wachswurms in einer Weise, dass Schäden am Larvenkörper minimiert und der volle Bolus geimpft wird.
Dann injizieren Sie die vollen 10 Mikroliter Candida inoculum, und extrahieren Sie die Nadel. Beherbergen Sie bis zu 10 Larven aus der gleichen Candida-Kultur in jeder 100-mal-15-Millimeter-Petrischale nach der Impfung und bebrüten die Larve acht Tage lang bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Gerichte alle 24 Stunden, um den Tod zu überwachen.
Die Sterblichkeit kann zunächst durch verdunkelte Pigmentierung, die Bildung von schwarzen Flecken oder Körpern und Bewegungsmangel beurteilt werden. Um die Sterblichkeit zu bestätigen, verwenden Sie eine Pinzette, um moribunde Larven sanft auf ihren Rücken zu rollen und die Unterseite der Larve mit der Pinzette leicht zu stochern. Larven, die beginnen, in Motten zu verpupvern, können in die Analyse einbezogen werden, sollten aber entfernt werden, wenn sie anfangen zu molten.
Es besteht kein signifikanter Unterschied in der Kinetik des G.mellonella-Todes zwischen Larven, die null oder 10 Tage nach der Ankunft infiziert sind. Die charakteristischen Krankheitszeichen entstehen bei Larven aus beiden Altersgruppen, die der Infektion erliegen, beginnend mit Verfärbungen, die schwarzen Flecken vor einem totalen Verlust der Beweglichkeit und schließlich dem Tod weichen. Die Infektion mit C.albicans beschleunigt diesen Prozess der Verfärbung und Morbidität, verändert aber nicht signifikant die Kaskade von phänotychen Markern, die zum Tod führen, im Vergleich zu nicht infizierten oder PBS-injizierten Larven.
Insbesondere die Infektion von G.mellonella mit paarenden typähnlichen Homo- oder Heterozygoten aus einem der getesteten klinisch isolierten C.albicans-Stämme führt zu hohen Sterblichkeitsraten im Vergleich zu PBS-injizierten Tieren, während Injektionen von prototrophen Derivatestämmen die tödliche Wirkung in diesem Modell dämpfen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, gesunde Larven zu wählen und sanft mit den Larven umzugehen. Wenn mehrere Stämme geimpft werden, achten Sie darauf, dass die Candida-Zellen nicht zu lange im PBS sitzen.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie immunologische Profilierung und Candida-Lokalisierung innerhalb von Larven durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die Wechselwirkungen zwischen dem Wirt und Pilzerreger während einer Infektion zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, Candida Pathogenese mit Hochdurchsatzformaten zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Candida albicans Sorgfalt erfordert und dass Standardvorkehrungen, einschließlich des Tragens von persönlichen Schutzausrüstungen, immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
