CR Harding wurde von der Wellcome Trust-Stipendium WT086724 unterstützt.

1. Vorbereitung von L. pneumophila für Infektions <ol><li> Vorbereitung Kohle Hefeextrakt (CYE) Platten (2 g / L Aktivkohle, 10 g / L Hefeextrakt, 13 g / l Agar, 10 g / l N-(2-Acetamido)-2-aminothanesulfonic Säure (ACES), 1 g / l α-Ketoglutarat, 0,4 g / l L-Cystein-HCl und 0,25 g / l Eisenpyrophosphat, pH 6.9). Hinweis: Falls erforderlich, fügen Kanamycin (25 ug / ml) und / oder Chloramphenicol (6 pg / ml), um Platten CyE. <ol><li> Führen Sie alle L. pneumophila Arbeit an biologischen Sicherheit Stufe 2 (BSL-2) in einer mikrobiellen Sicherheitsschrank (MSC) in Übereinstimmung mit den lokalen Vorschriften. </li></ol></li><li> Streak L. pneumophila von -80 ° C Glycerin-Stamm auf CYE Platten </li><li> Inkubation erfolgt für 4 Tage bei 37 ° C. Hinweis: Die Inkubation der Platten für 4 Tage die Virulenz von L. deutlich erhöht pneumophila in G. mellon über Inkubation für 3 Tage. </li><li> Einen Tag vor der Infektion, eine Schleife zu suspendieren full von Bakterien (die mehrere Kolonien) in 1 ml vorgewärmtem (37 ° C) ACES Hefeextrakt (AYE) Brühe und die Extinktion bei 600 nm (OD 600) unter Verwendung eines Spektrophotometers. </li><li> Impfen ein frisches 3 ml AYE Kultur (mit Antibiotika falls erforderlich) zu einer endgültigen OD 600 von 0,1. <ol><li> Fügen Sie eine Medien nur steuern, um die Sterilität der Medien zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Inkubieren bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator bei 200 UpM für 21 Stunden. Hinweis: Die Bakterien sollten, um post-exponentiellen Phase für die Infektion 38 angebaut werden. Wachsen für 21 Stunden ermöglicht Experimente standardisiert werden. Hinweis: Wenn für die Proteininduktion erforderlich, fügen Sie 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-(IPTG) über Nacht. </li><li> Messen Sie die OD 600 (Bakterien sollten in post-exponentiellen Wachstumsphase, OD 600 von 2,5 bis 3 sein). </li><li> Verdünnte Bakterienkultur bis 1 × 10 9 CFU / ml in steriler Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) zu ergeben. Anmerkung: Basierend auf früheren Ergebnissen, eine OD 600 von 1 entspricht 1 x 10 9 CFU / ml, dies sollte jedoch für verschiedene L. bestätigt pneumophila-Stämme. Hinweis: wenn die Induktion eines Proteins aus einem Plasmid benötigt wird mit 1 mM IPTG zu dem Inokulum. </li><li> Teller des Inokulums, wie in Abschnitt 9 als Kontrolle zu gewährleisten, die erwartete CFU im Impfstoff vorhanden ist, beschrieben. </li></ol> 2. Vorbereitung der Larven <ol><li> Kaufen Sie ausreichend G. mellon Larven von einem kommerziellen Anbieter. Die Larven werden mit 5 oder 6. Larvenstadium Stufe (etwa zwischen 2-3 cm Länge) geliefert und sind für den Einsatz sofort. Hinweis: Eine Methode, die beschreiben, wie hinten Larven zuvor 39 beschrieben. Hinweis: Die Larven können bei Raumtemperatur für bis zu zwei Wochen gelagert und Lebensmittel nicht erfordert. Sofort verwerfen jede Larven Anzeichen von Verpuppung. </li><li> Bereiten Sie den Behälter für Larve von Placten einen Kreis von 10 cm Filterpapier in den Boden einer 10 cm Petrischale. </li><li> Mit stumpfer Spitze Pinzette, legen zehn gesunden Larven von etwa gleicher Größe in der Petrischale. Hinweis: Entsorgen Sie ungesund braun gefärbte oder fleckig suchen Insekten. Gesunde Larven gleichmäßig cremig ohne Bereiche mit dunklen Verfärbungen gefärbt und sind in der Lage, sich schnell, wenn rechts gewendet. </li></ol> 3. Die Infektion von G. mellon Larven <ol><li> Vorbereitung der Injektion Plattform durch Abkleben einen Kreis von Filterpapier auf die Oberfläche. </li><li> Kleben Sie einen P1000 Spitze horizontal auf das Filterpapier, eine Injektion Plattform. Das nicht steril sein. </li><li> Sterilisieren einer Mikrotiterplatte 20 &amp;mgr; l-Spritze durch Ansaugen von 70% Ethanol und Inkubation für mindestens 10 min. <ol><li> Tragen Sie pannensichere Handschuhe während der Injektion, </li></ol></li><li> Entfernen Sie das restliche Ethanol durch Ansaugen und Ausstoßen sterilem Wasser mehrmals. </li><li> Using die Spritze ansaugen 10 ul der L. pneumophila 1 × 10 9 CFU / ml Suspension. </li><li> Nehmen Sie eine Larve und vorsichtig, aber fest drehen ihn auf den Rücken, über dem P1000 Spitze gebogen. </li><li> Setzen Sie die Spitze der Spritze über den vorderen rechten proleg der Larven. </li><li> Sanft, legen Sie die Spitze der Nadel in die proleg, um sicherzustellen, dass es innerhalb der Larven ist, und gleichmäßig zu injizieren alle der Spritzeninhalt. Hinweis: Wenn die Spritze richtig eingelegt ist, sollte es möglich sein, holen die Larven nur mit der Spritze, um es in die Kammer zu stellen. <ol><li> Nach der Injektion beobachten, die Larven für einige Sekunden. Die Larven beginnen, nach ein paar Sekunden kriechen sollte aber Flüssigkeit nicht ausscheiden. </li></ol></li><li> Kurz beobachten die Larven ein paar Stunden nach der Infektion, Infektion mit 10 7 CFU L. pneumophila 130b keine Symptome innerhalb der ersten 5-8 h pi verursachen Deshalb, wenn Larven wenden grau / schwarz vor diesem Punkt, ter Experiment sollte abgebrochen werden. Hinweis: Inokulation von Larven mit 1 mM IPTG nicht über den Verlauf des Experiments beeinflussen Larven Lebensfähigkeit. </li><li> In der gleichen Weise, injizieren insgesamt 10 Larven pro Zustand einschließlich 10 Larven mit D-PBS injiziert, um als Kontrolle zu analysieren Larvensterblichkeit zu dienen. </li><li> Tape-Petrischalen verschlossen und in Auffang. </li><li> Inkubieren in einem bakteriellen Standard-Inkubator bei 37 ° C, für die Dauer des Experiments. </li></ol> 4. Vorbehandlung der Larven mit einem chemischen Inhibitor <ol><li> Vor der Infektion, bereiten Larven zur Injektion, wie in Abschnitt 3.1-3.6 beschrieben. </li><li> Injizieren 10 &amp;mgr; l einer 100 &amp;mgr; M Lösung von Cytochalasin D in die vordere, linke proleg von 10 Larven. Hinweis: Inhibitor in einer anderen proleg von Bakteriensuspension injiziert, um eine Verletzung der Larven zu reduzieren. </li><li> Spritzen Sie 10 ul DMSO in 10 Larven als Kontrolle. </li><li> Inkubation bei Larven37 ° C für 4 Stunden. </li><li> Inject vorbehandelt Larven wie in Abschnitt 3 beschrieben in den vorderen rechten Proleg entweder mit 1 x 10 7 CFU von WT L. pneumophila oder eine PBS-Kontrolle. </li></ol> 5. Analyse der Sterblichkeit der Larven <ol><li> Bei 18 Stunden nach der Infektion (pi), untersuchen alle infizierten Larven für die Mortalität. </li><li> Um die Sterblichkeit zu überprüfen, benutzt stumpfer Spitze Pinzette drehen Sie den Larven und suchen für die Bewegung der Beine, sollten gesunde Larven sich schnell aufzurichten. Pigmentierung zeigt eine starke Immunreaktion auf eine Infektion. Wenn es eine Bewegung, zählen als lebendig. </li><li> Rekordzahl von toten und lebenden Larven. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang bei allen anderen Zeitpunkten gewählt. Hinweis: Wenn die Inkubation für mehr als drei Tage lang fortgesetzt, Puppen kann gesehen werden. Entfernen Sie alle Puppen und einschläfern durch Einfrieren bei - 20 ° C vor der Metamorphose stattfinden kann. </li></ol> 6. Extraktion von Hämolymphe <ol><li> Zufällig wählen Sie dreiLarven und in einen 14-ml-Röhrchen zu ausgewählten Zeitpunkten wie 5 und 18 Stunden pi, </li><li> Stellen Sie das Röhrchen auf Eis für 5-10 min, bis keine Bewegung der Beine der Larven beobachtet werden. </li><li> Legen Sie die betäubt Larven auf einer Petrischale, und mit einem Skalpell, einen Einschnitt zwischen zwei Segmenten in der Nähe der Schwanz der Larven. </li><li> Drücken Sie die Larven in ein steriles 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen, die Hämolymphe zu sammeln. <ol><li> Pool Hämolymphe aus mindestens drei Personen. Eine Larven gibt zwischen 15-50 ul Hämolymphe je nach Größe. Anmerkung: Während der Hämolymphe Extraktion ist es sehr einfach, den Darm zu stören, was zu einer potentiellen Kontamination der Proben. Kontamination zu reduzieren, indem die Larven in der Nähe der Schwanz (vom Darm) wird jedoch Antibiotikaselektion immer erforderlich, wenn das Ausplattieren der Bakterien. Hinweis: Um die Hämolymphe von Bräunung und Koagulieren, Prozess die Hämolymphe innerhalb von 10 Minuten nach der Entnahme zu verhindern. </li></ol></li><li> Entsorgen Sie den Larvenkörper in eine neue 14 ml Falcon-Röhrchen, Dichtung und Ort bei - 20 ° C über Nacht, um sicherzustellen, die Larven tot sind. </li><li> Autoklav toten Larven und entsorgen nach den örtlichen Vorschriften. </li></ol> 7. Bestimmung der Lebensfähigkeit Hemocyte <ol><li> Extrahieren Hämolymphe wie oben beschrieben. </li><li> Mischungs 20 ul extrahiert Hämolymphe mit 20 ul 0,02% (v / v) Trypanblau in PBS in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte. </li><li> Inkubation für 5 min bei RT. </li><li> Last 10 ul Hämolymphe auf eine Hämozytometers und zählen praktikable (nicht blau)-Zellen. </li><li> Graf jede Probe in dreifacher Ausfertigung an Fehler zu reduzieren. </li></ol> 8. Die Verarbeitung der Heraus Hämozyten für Immunfluoreszenz-Mikroskopie <ol><li> Mischen Sie die gepoolten Hämolymphe aus mindestens drei Larven und Pipette auf einem 10-15 mm Deckglas in einer 24-Well-Platte extrahiert. Hinweis: Die Deckgläser benötigen keine Behandlung, wie Blutzellen kann auf Glas haften. </li><li> 0,5 ml des D-PBS und gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. </li><li> Zentrifugieren der Platte 10 min bei 500 × g bei Raumtemperatur (RT) unter Verwendung eines Aerosoldichte Zentrifugenhalter. </li><li> Untersuchen Sie jede Vertiefung mit einem inversen Mikroskop zu überprüfen, dass die Blutzellen haben, eingehalten werden. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und sorgfältig waschen Sie die Zellen dreimal durch Zugabe von 0,5 ml D-PBS auf die Wand des Bohrlochs, rockt die Platte 2-3x und Entfernen der D-PBS mit einer Pipette. </li><li> Fixieren die Zellen durch Zugabe von 0,5 ml 4% (v / v) Paraformaldehyd (PFA) in PBS. </li><li> Inkubieren der Zellen für 20-30 min bei RT. </li><li> Mit D-PBS waschen die Zellen dreimal wie zuvor. </li><li> 0,5 ml 15 mM NH 4 Cl in PBS Rest PFA löschen und Inkubation bei RT für 15 min. </li><li> Mit D-PBS Waschen Sie die Zellen dreimal. Anmerkung: In diesem Stadium können die Deckgläser über Nacht bei 4 ° C gelagert werden </li><li> 0,5 ml 0,1% Triton X-100 in PBS und Inkubation für 5 min bei RT, um Zellen zu permeabilisieren. </li&gt; <li> Block 1 h mit Blockierlösung (2% (w / v) BSA in PBS). </li><li> Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln mit dem primären Antikörper in Blockierungslösung zu der vom Hersteller angegebenen Verdünnung verdünnt. </li><li> 3x Waschen mit PBS. </li><li> Inkubation für 1 Stunde mit dem sekundären Antikörper und DAPI-Visualisierung von Bakterien, wie oben. </li><li> 3x mit PBS waschen. </li><li> Montieren Sie die Deckgläschen mit einem Tropfen Reagenz Montage auf Glasobjektträger. </li><li> Inkubieren über Nacht im Dunkeln bei RT, um den Montagelösung vollständig trocknen. </li><li> Bild gleitet auf einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> 9. Die Quantifizierung der bakteriellen CFU <ol><li> In 100 ug / ml Spectinomycin Platten CyE Verunreinigungen durch Darmflora zu vermeiden. L. pneumophila Stamm 130b ist von Natur aus resistent gegen Spectinomycin 40. </li><li> Vor der Hämolymphe Extraktion, wiegen 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Auszug Hämolymphe, wie in Abschnitt 6 beschrieben und legen in t gewogenUBEs, fügen 1 ul von 5 mg / ml Digitonin, gut mischen und Inkubation für 5 min bei RT, um Blutzellen zu lysieren. </li><li> Erneut wiegen, das Rohr mit Hämolymphe und bestimmen das Gewicht der Hämolymphe extrahiert. </li><li> Führen zehnfache serielle Verdünnungen der Hämolymphe in sterilen AYE Medien. </li><li> Mit einem Stift, teilen Sie die Basis eines CYE Platte in sechs gleich große Sektoren und Label. </li><li> Platte drei Tropfen von 25 &amp;mgr; l jeder Verdünnung (beginnend mit der verdünnten) in jedem Abschnitt der Platte. </li><li> Die Platten mit den Deckel über Nacht bei 37 ° C inkubieren Upmost </li><li> Sobald die Tropfen vollständig getrocknet, drehen Sie die Platte über und bei 37 ° C für mindestens weitere zwei Tage. </li><li> Quantifizierung der Bakterien durch Zählen der Kolonien auf jeder Verdünnung entnommen und zu normalisieren, um dem Gewicht der Hämolymphe extrahiert. </li></ol> 10. Bestimmung der Competitive Index (CI) <ol><li> Bestätigen Sie, dass beide Stämme wachsen ebenso gut in Bouillonkultur und CYE-Agar-Platten Prior, um zu versuchen, die Wettbewerbsindex. </li><li> Bereiten WT oder Kanamycin resistente Mutante Bakteriensuspensionen, wie in Kapitel 1 beschrieben und Mischung in einem Verhältnis von 1:1. <ol><li> Platte serielle Verdünnungen des Inokulums auf CYE Spectinomycin (100 ug / ml) und Spectinomycin CYE / Kanamycin </li></ol></li><li> Larven zu infizieren und zu extrahieren Hämolymphe zu geeigneten Zeitpunkten, wie oben beschrieben. </li><li> Bestimmen Keimzahl durch Extraktion Hämolymphe und Beschichtung serielle Verdünnungen auf CYE Spectinomycin und CYE Spectinomycin / Kanamycin. </li><li> Berechnen Sie die Wettbewerbsindex (CI), wie folgt: CI = (Mutante Ausgang / WT-Ausgabe) / (Mutante Inokulum / WZ-Impfstoff). </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Galleria mellonLarven Modell für Legionella pneumophila-Infektion ist ein nützliches Werkzeug für die in-vivo-Studien der Pathogenese. Hier wird gezeigt, dass eine Anzahl von Aspekten der Makrophageninfektion in G. rekapitulieren mellon Modell, einschließlich der Rolle der Dot / Icm T4BSS in der Virulenz und bakterielle Replikation und der Lokalisation der Dot / ICM-Effektor SidC. Darüber hinaus zeigen wir, dass ein chemischer Inhibitor der Aktin-Polymerisation reduziert Larvensterblichkeit, imitiert ergibt macophages 47 erhalten, und Nachweisen, daß die Internalisierung von den Bakterien benötigt, um Larvensterblichkeit führen. Zuvor wurde gezeigt, daß die Variationen in der Virulenz von L. pneumophila-Stämme in anderen Infektionsmodellen gesehen in G. prüft werden mellon und die Induktion von Virulenzfaktoren in post-exponentiellen Wachstumsphase zur Behandlung von bakteriellen Virulenz erforderlich <sup&gt; 36, bestätigt, dass G. mellon ist ein geeignetes Modell für L. pneumophila-Infektion. Die Bestimmung der CFU von L. pneumophila infizierten Larven von entweder einzeln oder in Mischinfektionen, die Nützlichkeit des Modells erhöht. Zuvor mehreren Faktoren entdeckt worden, dass subtile Effekte auf bakterielle Replikation in einem oder mehreren Modellen von Infektion 29,48-51 haben. Obwohl die Larven nicht ein adaptives Immunsystem besitzen, die Anwesenheit der angeborenen Immunantwort bietet eine stärkere Auswahl im Vergleich zu Makrophagen allein, die dazu dienen können, subtile Phänotypen zu verstärken. Daher ist es möglich, dass, während diese Stämme werden wahrscheinlich nicht wesentlich Larvensterblichkeit auswirken, können sie zeigen, verminderte bakterielle Replikation oder Fitness in der G. mellon Modell. Neben der Replikation von L. pneumophila in den Larven haben wir bedeutende hemocyte Erschöpfung spät in der Infektion gezeigt. Als L.pneumophila wird erwartet, um Wirtszellen zu lysieren, am Ende seines Replikationszyklus, Messen hemocyte Verarmungs kann auch als eine indirekte Messung der bakteriellen Replikation dienen. Hemocyte Erschöpfung zuvor mit Insektensterblichkeit in 3,52 Infektion korreliert, auch wenn die letzten Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Bild ist komplexer als erste belived 37. Kürzlich wurde gezeigt, dass Verhungern der Larven führt zu einer erhöhten Anfälligkeit für Infektionen durch eine Unterdrückung von Immunantworten 53. Bei den hier beschriebenen Tests wurden Larven nicht für die Dauer der Untersuchung zugeführt und es ist nicht bekannt, wie gut gefüttert Larven würde L. antworten pneumophila-Infektion. Einer der Vorteile von G. mellon als Modellorganismus ist die einfache Extraktion und Quantifizierung von Blutzellen von infizierten Larven. Vorherige Videos wurden verschiedene Methoden zur Extraktion von Blutzellen von Insekten 54,55 jedoch gezeigt, die erfüllthod ist einfach und eignet sich für die sofortige Verarbeitung vorgestellt. Einmal extrahiert können Blutzellen leicht quantifiziert werden, Immunfluoreszenz, Transmissionselektronenmikroskopie 36 verwendet oder Durchflusszytometrie oder 56 kultiviert und ex vivo infiziert 3 ermöglicht die Reaktion der Zellen auf eine Infektion, im Detail untersucht werden. Dies erhöht die Flexibilität des Modells. Eine Einschränkung in G. Immunfluoreszenz mellon ist das begrenzte Angebot von Antikörpern gegen G. validiert mellon Proteinen. Studien haben jedoch die Schaffung von Antikörpern gegen Proteine ​​Larven 57 und Antikörper gegen menschliche Immun verwandte Proteine ​​nachgewiesen wurden gefunden, um G. erkennen mellon Proteine ​​11 zeigen das Potenzial für Immunfluoreszenz auf G. mellonBlutZellen. Die Leichtigkeit der G. mellon Infektion ermöglicht eine schnelle, mittlere Durchsatz-Screening Das könnteverwendet, um die Virulenz von verschiedenen Legionella-Arten und Stämme zu vergleichen und könnte verwendet werden, um zuvor identifizierte Virulenzfaktoren wie Adhäsionsmoleküle 58 oder der Typ-2-Sekretionssystem 59, die für die Virulenz in anderen Modellen benötigt werden weiter analysieren. Darüber hinaus wird die Verwendung dieses Modells die Identifizierung und weiteren Charakterisierung neuer Virulenzfaktoren einschließlich sezerniert und transloziert Effektor-Proteine ​​ermöglichen. Kürzlich wurde gefunden, dass die Phospholipase-C-Aktivität von L. gezeigten pneumophila hat eine Rolle in G. mellon Virulenz 60 und dass der Dot / Icm Effektorprotein SDHA ist für die Virulenz 37 erforderlich. Darüber hinaus haben wir kürzlich gezeigt, dass es eine Korrelation zwischen den in G. beobachteten Phänotypen mellon und im A / J-Mausstamm 37. Dies unterstreicht den Wert dieses Werkzeug, um Umwelt Protozoen und einzelligen Wirt und muri ergänzenne Infektionsmodellen. Die G. mellon Modell wird in Zukunft noch wertvoller werden, sobald die Larven genomischen Sequenz verfügbar sein wird und mehr genetische Werkzeuge etabliert sind. Schritte in diese Richtung sind die jüngsten Publikation der Immun-Transkriptom-61 und die Bildung einer Initiative zur Gen-Silencing in Lepidoptera spp 62 voranzutreiben. Durch die Verwendung von G. mellon Larven, haben wir eine Reihe von einfachen, schnellen Auslesen der bakteriellen Virulenz, die verwendet werden können, die Pathogenese von L. untersuchen pneumophila. Gründung dieser Assays und breiter Screening von L. pneumophila-Stämme und Serogruppen wird den Nutzen dieses neuen Werkzeugs erhöhen und zu unserem Verständnis von L. beitragen pneumophila Pathogenese.

Tiermodellen der Infektion wurden bei der Bestimmung der Virulenzfaktoren von unschätzbarem Wert erwiesen. Allerdings haben wirbellosen Modelle erhöhte Aufmerksamkeit als eine praktikable Alternative zu traditionellen Säugetiermodelle der Infektion gewonnen. Die Larven der Wachsmotte Galleria mellon wird zunehmend verwendet, um eine Reihe von wichtigen Humanpathogene, einschließlich Gram-positiven und Gram-1-negativen Bakterien 2,3 und mehrere pathogene Pilze 4,5 studieren. Verwendung eines Insekten-Modell hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber traditionellen Säugermodellen als wirbel, G. mellon unterliegt nicht den ethischen Grenzen der Säugetier-Modelle. Darüber hinaus können die Larven leicht aufrechterhalten werden, ohne Anästhesie durch Injektion infiziert zogen Vorbehandlung mit chemischen Inhibitoren 6 und aufrechtzuerhalten Inkubation bei 37 ° C 7. Interessanterweise konnte eine gute Korrelation zwischen der Pathogenität von mehreren Mikroorganismen in G. mellonella und Säugetiermodelle der Infektion wurde 2,8 etabliert. Der besseren Verständnis des Immunsystems von G. mellon auch bei der Charakterisierung dieser Modellorganismus unterstützt. Obwohl Insekten nicht über ein adaptives Immunsystem wie in Säugetieren gefunden, haben sie anspruchsvolle Mobilfunk-und Oberarmabwehrkräfte einschließlich der Produktion von antimikrobiellen Peptiden 9. Blutzellen sind die wichtigsten Vermittler der zellulären Abwehrkräfte und sind die zahlreichen Zelltyp in der Hämolymphe (oder Blut) von G. gefunden mellon 10, Diese Zellen sind professionelle Phagozyten und ähnliche Funktionen an humanen Makrophagen und Neutrophile sowohl Aufnahme und abbauenden Bakterien in einer phago-lysosomalen Kompartiment 10,11 und bildet Knötchen um eindringende Bakterien, bakteriellen Replikations physisch beschränken 12. Legionella pneumophila ist ein Erreger, der schwere Atem pneumoni verursachta (Legionärskrankheit) bei empfindlichen Bevölkerungsgruppen wie ältere Menschen oder immungeschwächten 13. Legionellen ubiquitär sowohl Umwelt-und künstlichen Wasserquellen, wo es ist ein Krankheitserreger der verschiedenen Arten von Süßwasser 14,15 Amöben gefunden. Legionellen überlebt und repliziert innerhalb dieser professionellen Phagozyten durch Verwendung eines Multiprotein-Komplexes als Dot / Icm (in Organellen Handel defekt / intrazelluläre Vermehrung) bekannten Typ 4 Sekretionssystem (T4SS) bis über 275 Effektor-Proteine ​​in der Wirtszelle 16-20 translozieren. Diese Proteine ​​dienen, die normalen Wirtszelle phagocytic Wege untergraben, die zur Schaffung des Legionella Vakuole (LCV) mit. Die LCV vermeidet Fusion mit Lysosomen und stattdessen rekrutiert endoplasmatischen Retikulum (ER) abgeleiteten Vesikeln, was in einem spezialisierten Kompartiment, das die raue ER 21,22 ähnelt. L. pneumophila gilt als eine zufällige menschlichen Wegogen, die gleichen Strategien, die es ermöglichen, innerhalb von Amöben zu replizieren, auch die Replikation in menschlichen Alveolarmakrophagen 23. Säugetierwirte als Modelle für menschliche Legionella-Infektion einschließlich Mäusen und Meerschweinchen 24,25 gekennzeichnet. Die Mehrheit der Mausstämme sind jedoch resistent gegen Legionella-Infektion 26 mit Ausnahme des Inzucht Albino A / J-Maus, die eine leichte, selbstbegrenzenden Infektion 24 entwickelt. Obwohl das Meerschweinchen-Modell ähnelt mehr 25 Menschen eine Krankheit, das Fehlen von Mutanten und erhöhten Kosten schreckt ihre Verwendung 27. Außerdem haben mehrere wirbel Modelle für Legionella pneumophila-Infektion entwickelt, einschließlich Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 und verschiedene Arten von Amöben 30-32. Allerdings haben diese Modelle Schwächen, Virulenz im C. elegans </em&gt; System ist nicht Dot / ICM-abhängige 28, die Begrenzung der Nutzen dieses Modells. Die Drosophila-Modell hat sich in der Untersuchung von bakteriellen Virulenzfaktoren und 29 scheint jedoch vielversprechend erwiesen, dieses Modell nicht vollständig charakterisiert. Einzellige Amöben sind die Umwelt Gastgeber von L. pneumophila und eignen sich für die Untersuchung der Wirkung von Virulenz-Faktoren auf molekularer Ebene 33 fehlt jedoch mehrere wichtige Mediatoren von Säuger-Wirtszellantwort auf eine Infektion wie Caspasen 34. Die Schwächen der bestehenden Modelle, zusammen mit den hohen Kosten und ethische Bedenken auf Säugetier Experimente verwandt, hat mit der Suche nach anderen geeigneten Modellorganismen 29,35 geführt. Wir haben kürzlich gezeigt, dass G. mellon ist ein geeignetes Modell für L. pneumophila Pathogenese 36,37. Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Techniken für infizieren verwendeting G. mellon Larven, Analyse Larven Moral, Extrahieren Hämozyten für Zähl-und Immunfluoreszenz und die Bestimmung der Replikation von lebensfähigen Keimzahl von infizierten Larven.

<table border="1">
 <tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material/ Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ACES yeast extract (AYE) broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g &alpha;-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* 
		 *add sterile ingredients after autoclaving</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6526 </td>
			<td>0.6 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile cysteine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td>3.3 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>G. mellonella (waxworms)</td>
			<td>Livefood UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9037</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Legionella LPS</td>
			<td>Cambridge Biosciences</td>
			<td>PA1-7227 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG Alexa488</td>
			<td>Jackson Immunoreach</td>
			<td>711-485-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1026</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Biomol International</td>
			<td>BML-T109-0001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td>[header]</td>
 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microtiter Syringe</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24544</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell counter, double, Improved Neubauer </td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0926</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For centrifuging plates </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For viable cell counting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puncture-proof glove</td>
			<td>Turtleskin </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
 </tbody>
 </table>

use of galleria mellonella as a model organism to study legionella pneumophila infection

Legionella pneumophila ist der Erreger einer schweren Lungenentzündung namens Legionärskrankheit, eine wichtige menschliche Krankheitserreger, der infiziert und repliziert in Alveolarmakrophagen. Seine Virulenz hängt von der Dot / Icm Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS), die unerlässlich ist, um eine Replikation permissive Vakuole als Legionella Vakuole (LCV) bekannt zu etablieren. L. pneumophila-Infektion in Mäusen modelliert werden, aber die meisten Mausstämmen nicht permissive, was zu der Suche nach neuen Infektionsmodellen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Larven der Wachsmotte Galleria mellon eignen sich für die Untersuchung von L. pneumophila-Infektion. G. mellon wird zunehmend als Infektionsmodell für menschliche Krankheitserreger verwendet, und eine gute Korrelation zwischen Virulenz der verschiedenen Bakterienarten gibt es in der Insekten-und in Säugetiermodellen. Ein wichtiger Bestandteil der Immunabwehr der Larven sind Blutzellen, Berufal Phagozyten, die bis Eindringlinge zu nehmen und zu zerstören. L. pneumophila in der Lage ist, zu infizieren, einen Transporter und replizieren in diesen Zellen. Protokolle zur Analyse von L. Hier zeigen wir, pneumophila Virulenz in G. mellon-Modell, darunter, wie man Infektions L. wachsen pneumophila, vorzubehandeln, die Larven mit Inhibitoren, infizieren die Larven und wie auf infizierte Zellen für die Quantifizierung und Immunfluoreszenz-Mikroskopie zu extrahieren. Wir beschreiben auch, wie bakterielle Replikation und Fitness im Wettbewerb Assays quantifizieren. Diese Ansätze ermöglichen die schnelle Screening von Mutanten Faktoren in L. wichtig festzustellen, pneumophila Virulenz, beschreibt ein neues Werkzeug, um unser Verständnis dieses komplexen Krankheitserreger unterstützen.

Hier wird gezeigt, dass G. mellon ist eine geeignete, einfach zu bedienen Modell zu studieren L. pneumophila-Infektion. Zuvor wurde gezeigt, dass L. pneumophila Virulenz in Makrophagen, Amöben und Säugetiermodelle abhängig von der Anwesenheit des Dot / Icm Sekretionssystem 41-43. G. mellon Larven wurden infiziert, wie oben beschrieben, und der Virulenz des Wildtyps (WT) und Dot / ICM-defizienten Stamm verglichen. Infektion mit 10 7 CFU von L. pneumophila Stamm 130b in Folge 100% Mortalität innerhalb von 24 Stunden nach der Infektion (pi). Jedoch die L. Δ DOTA pneumophila-Stamm, der nicht über eine funktionelle Dot / Icm T4SS Sekretionssystem war avirulent in diesem Test (Fig. 1). Dies zeigt, dass L. pneumophila Virulenz in G. mellon hängt von der Translokation von Dot / Icm Effektoren, so dass dieses Modell geeignet für die Charakterisierung vondie Funktion dieser Proteine. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Hemmung der Phagozytose durch Cytochalasin Behandlung die anfällig für die Infektion von Larven der Hefe Candida albicans 6. Als L. pneumophila ist ein intrazelluläres Pathogen, wurde beschlossen, festzustellen, ob die Aufnahme der Bakterien ist von entscheidender Bedeutung in der Pathogenese in diesem Modell. Larven wurden mit 10 &amp;mgr; l 100 &amp;mgr; M Cytochalasin D (CyD) für 4 h bei 37 ° C vorbehandelt, dann mit 10 7 CFU von WT L. infiziert pneumophila 130b und Mortalität bei 24 Stunden pi Behandlung mit dem Inhibitor allein überwacht hatte keinen Einfluss auf das Überleben der Larven. Jedoch angezeigt vorbehandelt, infizierten Larven signifikant höhere Überlebensrate (p = 0,0066, ungepaarter t-Test) im Vergleich zu DMSO-behandelten infizierten Insekten (Abbildung 2). Die Wirkung der Behandlung wurde durch CyD 48 h pi (Ergebnisse nicht gezeigt) aufgehoben, kann dies aufgrund der Halbwertszeit des Medikaments in G.mellon. Dies zeigt, dass die Aufnahme von L. pneumophila in G. mellonBlutZellen ist ein entscheidender Aspekt der bakteriellen Virulenz. Um die Expression zu bestätigen und zu bestimmen, die subzelluläre Lokalisierung eines Effektor-Protein G. mellon, Blutzellen wurden gewonnen und für die Immunfluoreszenzmikroskopie weiterverarbeitet. Die Larven wurden mit WT-und Δ Dota L. pneumophila 130b ein Fragment des gut definierten T4SS Effektor, SidC 41-918, 4 N-terminalen HA-Tags fusioniert ausdrücken infiziert. Dieser Effektor wurde gezeigt, um die LCV über eine Phosphoinositid-4-phosphat-Bindungsdomäne 44 zu binden. Mit Anti-HA-(rot) und Anti-Legionellen-(grün) Antikörper, 4HA-SidC 41-918 an der LCV in infizierten Blutzellen lokalisiert (Abbildung 3). Diese Lokalisierung hat zuvor in der Amöben Dictyostelium discoideum und in Säuger Makrophagen 44,45 Bestätigung der c gezeigtomparability dieses Modells. Die Bedeutung der Proteine ​​für die Virulenz ist in der Regel durch den Vergleich der Wachstumskinetik von Wildtyp und Mutante Bakterien bestimmt. Um die bakterielle Replikation Kinetik über den Verlauf der Infektion zu verfolgen, wurden drei Larven zu jedem Zeitpunkt geopfert (0, 5, 18 und 24 Stunden pi), die Hämolymphe gesammelt und vereinigt und das CFU/0.1g extrahierter Hämolymphe bestimmt. Nach einer ersten Bad im 5 h pi, der CFU der WT Bakterien um bis zu 24 h pi jedoch die Δ Dota Belastung erfährt keine Replikation und ist bei 18 h pi (Abbildung 4) gelöscht. Die Fähigkeit von L. pneumophila zur Lyse der Makrophagen in einer T4SS abhängig führen seit langem dokumentiert 46, jedoch keine ähnlichen Studien in vivo durchgeführt. Die Konzentration von zirkulierenden Blutzellen wurde bei 5, 18 bestimmt, und 24 Stunden pi Larven infiziert wurden mit WT oder Δ <em&gt; DotA L. pneumophila 130b, Blutzellen von infizierten Insekten und lebensfähigen Zellen unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussverfahren gezählt extrahiert. Bei 5 h pi keinen Unterschied in hemocyte Zählungen zwischen den Stämmen konnte (Fig. 5) ersichtlich. Doch bei 18 h pi gab es einen signifikanten Rückgang der hemocyte Konzentration in WT, aber nicht Δ Dota, infizierten Larven. Dieser Unterschied blieb nach 24 Stunden pi Der Abfall der Blutzellen-Nummer, verbunden mit der Anwesenheit von intrazellulären Bakterien, wie durch Immunfluoreszenz gesehen, legt nahe, dass L. pneumophila repliziert innerhalb von Blutzellen lysiert sie dann, so dass die Bakterien zu mehreren Replikationsrunden durchlaufen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Infektion mit L. pneumophila induziert Dot / ICM-abhängigen Larvensterblichkeit. 10 Larven wurden mit PBS allein oder 10 infiziert <sbis&gt; 7 CFU von Wildtyp (WT) oder Δ Dota L. pneumophila 130b, bei 37 ° C für 72 h und zum Zeitpunkt des Todes der Larven aufgenommen inkubiert. Alle Larven mit dem WT infiziert erlag der Infektion innerhalb von 24 Stunden nach der Infektion (pi), jedoch keine Mortalität wurde in Larven mit PBS allein oder der Δ Dota Stamm beimpft gesehen. Die Ergebnisse sind der Mittelwert von drei getrennten Experimenten ± Standardabweichung. <img alt="Figur 2" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig2.jpg" /> 2. Die Sterblichkeit ist abhängig von bakteriellen Internalisierung. L. 10 pneumophila Larven wurden mit 10 ul 100 uM Cytochalasin D (CyD) für 4 h bei 37 ° C, dann mit 10 7 WT und Mortalität nach 24 Stunden pi Vorbereitete Larven infiziert überwacht vorbehandelt, zeigten eine signifikant (P = 0,0066, ungepaarter t-Test) vermindert Sterblichkeit. Die Ergebnisse stellen den mean von vier unabhängigen Experimenten ± Standardabweichungen mit 10 Larven pro Zustand. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig3.jpg" /> 3. Immunfluoreszenz-Bildgebung der Effektor-Proteine ​​in Blutzellen extrahiert. Hämozyten wurden von Larven, die mit L. infiziert extrahiert pneumophila 130b WT Δ oder Dota-exprimierenden 4HA SidC 41-918 bei 5 h pi wurden die Zellen mit anti-HA-(rot) und Anti-Legionellen-(grün) Antikörpern und DNA-Farbstoff DAPI (blau), um die Kerne zu visualisieren gefärbt. 4HA-SidC 41-918 beobachtet umliegenden WT, aber nicht Δ Dota, Bakterien. Maßstabsbalken 5 um. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig4.jpg" /> 4. L. pneumophila repliziert in G. mellonella in einem Dot / ICM-abhängige Weise. Larven wurden mit WT oder Δ Dota L. pneumophila und bei 0, 5, 18 infiziert und 24 h pi die Hämolymphe von drei infizierten Insekten gesammelt, auf CYE-Platten und die CFU bestimmt und zu dem Inokulum und dem Gewicht der Hämolymphe extrahiert normalisiert. WT L. pneumophila repliziert im Laufe des Experiments, während das Δ DOTA Stamm wurde innerhalb von 18 h pi Ergebnisse gelöscht sind der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung. <img alt="Figur 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig5.jpg" /> 5. Infektion mit L. WT pneumophila führt zu erheblichen hemocyte Zerstörung. Hämozyten wurden bei 5, 18 extrahiert und 24 h pi aus Larven mit WT oder Δ Dota L. pneumophila und lebensfähigen Zellen mit einer Zählkammer gezählt infiziert. Kein Unterschied in derAnzahl der Zellen wurde mit 5 hr pi zwischen den Stämmen gesehen, jedoch bei 18 h pi nur etwa 15% der Blutzellen in Larven mit dem WT-Stamm infiziert, verglichen mit der Δ DOTA Stamm bleiben. Die Ergebnisse sind der Mittelwert von drei getrennten Experimenten ± Standardabweichung.

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Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Die Larve der Wachsmotte Galleria mellon wurde vor kurzem als ein in vivo Modell, um Legionella pneumophila-Infektion zu studieren etabliert. Hier zeigen wir grundlegende Techniken, die Pathogenese von Legionellen in den Larven charakterisieren, einschließlich Impfung, Messung der bakteriellen Virulenz und Replikation sowie die Extraktion und Analyse von infizierten Blutzellen.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

40.0K Aufrufe.  Imperial College London.  Die Larve der Wachsmotte Galleria mellon wurde vor kurzem als ein in vivo Modell, um Legionella pneumophila-Infektion zu studieren etabliert. Hier zeigen wir grundlegende Techniken, die Pathogenese von Legionellen in den Larven charakterisieren, einschließlich Impfung, Messung der bakteriellen Virulenz und Replikation sowie die Extraktion und Analyse von infizierten Blutzellen. 

Serie: Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

Das Insekt<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als leistungsfähiges Infektion Modell zur bakterielle Pathogenität Untersuchen

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Aufbau und Optimierung eines Hochdurchsatz-Setup zum Studium<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Und<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion als Modell für Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of nitrate to nitrite by gut and salivary bacteria. However, in other mammalian studies, high nitrite levels do not cause birth defects, although they can lead to poor reproductive outcomes. Thus, the teratogenic potential of nitrite is not clear. It would be useful to have a vertebrate model system to easily assess teratogenic effects of nitrite or any other chemical of interest. Here, we demonstrate the utility of zebrafish (Danio rerio) to screen compounds for toxicity and embryonic defects. Zebrafish embryos are fertilized externally and have rapid development, making them a good model for teratogenic studies. We show that increasing the time of exposure to nitrite negatively affects survival. Increasing the concentration of nitrite also adversely affects survival, whereas nitrate does not. For embryos that survive nitrite exposure, various defects can occur, including pericardial and yolk sac&#160;edema, swim bladder noninflation, and craniofacial malformation. Our results indicate that the zebrafish is a convenient system for studying the teratogenic potential of nitrite. This approach can easily be adapted to test other chemicals for their effects on early vertebrate development.

Exposure to teratogens may cause birth defects. Zebrafish are useful for determining the teratogenic potential of chemicals. We demonstrate the utility of zebrafish by exposing embryos to various levels of nitrite and also at different times of exposure. We show that nitrite can be toxic and cause severe developmental defects.

Zebrafisch als Modell zur Bewertung der teratogene Potenzial von Nitrit

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...