Mit diesem Protokoll zeigen wir zum ersten Mal den Schrittweiseprozess zur Induktion haariger Wurzeln in tartärem Buchweizen. Diese Technik ist einfach und kostengünstig für den Einstieg in die Genomik und Mikrobiomik für herbbucher und andere Pflanzen. Obwohl diese detaillierte Methode für tartary Buchweizen eingerichtet ist, kann es auf andere Dicot-Pflanzen mit einigen Modifikationen angewendet werden.
Obwohl diese Methode einfach durchzuführen ist, hat sie viele detaillierte Schritte. Visuelle Demonstration kann Forschern helfen, eine effizientere haarige Wurzelinduktion zu erreichen. Demonstriert wird das Verfahren von Guangtao Qian, einem Master-Studenten aus meinem Labor.
Beginnen Sie mit der Auswahl von prallen und unbeschädigten tartären Buchweizensamen und dem Einweichen der Samen in 28 Grad Celsius Wasser für ca. 20 Minuten. Wenn die Samenschicht leicht entfernt werden kann, legen Sie 100 bis 200 geschälte Samen 30 Sekunden lang in einen sterilisierten 100-Milliliter-Konuskolben mit 75 % Ethanol. Am Ende der Sterilisation das Ethanol durch 5% Natriumhypochlorit ersetzen.
Nach 15 Minuten das Natriumhypochlorit dekantieren und die Samen fünfmal mit sterilem entionisiertem Wasser waschen. Dann die Samen mit einem Stück sterilem bibulösem Papier trocknen. Um herb Buchweizen-Sämlinge zu erhalten, fügen Sie 10 Samen pro Flasche zu einzelnen 300 Milliliter Pflanzengewebe Kulturflaschen mit 50 Milliliter MSSA Medium.
Dann keimen die Samen in einem Kulturraum bei 25, plus oder minus 1 Grad Celsius bei Licht. Nach 7 bis 10 Tagen robuste Sämlinge mit zwei Stücken entfalteter Kotyledonen auswählen und die Sämlinge von den Wurzeln schneiden. Die Sämlinge in eine sterile Petrischale geben und die Hypocotyle in 0,8 bis 1 Zentimeter große Segmente schneiden.
Die Kotyledonen in etwa 0,5 Zentimeter große Stücke verdecken und die resultierenden Explanten unter Lichtbedingungen 24 Stunden lang vorkultieren. Am nächsten Tag die Expflanzen in einen sterilisierten 100 Milliliter Konuskolben übertragen. Um A.rhizogenes zu aktivieren, tauen Sie die Kultur auf Eis auf, bevor Sie die Bakterien gleichmäßig auf YEB-Festmedium mit Antibiotika für eine 12- bis 16-stündige Inkubation bei 28 Grad Celsius plattieren.
Am nächsten Morgen, wählen Sie eine monoklonale Kolonie für Kultur in einer neuen Petrischale, wie gerade gezeigt. Nach einer weiteren 12- bis 16-stündigen Inkubation impfen Sie die resultierenden monoklonalen Kolonien in einem sterilisierten 100 Milliliter konischen Kolben, der 20 Milliliter YEB-Festmedium mit Antibiotika bei 28 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute enthält, bis die optische Dichte bei 600 2,0 erreicht. Dann übertragen Sie 2-4% der bakteriellen Zellkultur in einen neuen 100 Milliliter konischen Kolben mit 20 Milliliter frischem YEB-Festmedium mit Antibiotika bei 28 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute für 4 bis 5 Stunden, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern etwa 0,5 erreicht.
Um eine haarige Wurzeltransformation zu induzieren, übertragen Sie die A.rhizogenes-Kultur in eine sterile 50 Milliliter konische Röhre und sammeln die Bakterien durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in MSSAS-Medium auf eine optische Dichte von ca. 0,2 aus und infundieren Sie die Suspension in den Kolben von Exmodulen. Nach 10 Minuten die Explants aus dem Kolben entfernen und mit einem Stück sterilem bibulösem Papier bestreichen.
Dann legen Sie ein steriles Stück Filterpapier mit 9 Zentimeterdurchmesser auf eine Schüssel mit MSSAAS-Medium und überlagern Sie die Expflanzen auf dem Filterpapier für eine dreitägige Inkubation bei 25 Grad Celsius im Dunkeln. Am Ende der Inkubation ca. 20 infizierte Explanten auf MSSACK-Mittel übertragen und die Pflanzen unter Lichtbedingungen bei 25, plus oder minus 1 Grad Celsius vertikal bebrüten. Nach 10 bis 14 Tagen Kultur, wählen Sie die haarigen Wurzeln, die ein weißes Aussehen und schnelles Wachstum zeigen und schneiden Sie die Wurzeln in zwei bis drei Zentimeter Stücke.
Zählt klar die Wurzeln auf einer sauberen Bank. Subkultur die Wurzelstücke in einem sterilisierten 100 Milliliter konischen Kolben mit MSSK Medium bei 25 Grad Celsius und 80 Umdrehungen pro Minute im Dunkeln, bis sie sich bis zum Boden des Kolbens überbreiten. Um die haarigen Wurzeln zu identifizieren, entfernen Sie alle tawny und kontaminiertbehaarten Wurzeln und wählen Sie diejenigen mit einem weißen Aussehen.
Wenn ein Reportergen verwendet wurde, überprüfen Sie die Wurzeln auf Fluoreszenz unter einem blauen oder leichten Dual-Ultraviolett-Transilluminator und wählen Sie die haarigen Wurzeln aus, die ein starkes fluoreszierendes Signal aufweisen. Dann trocknen Sie die Wurzeln mit saugfähigem Papier und wickeln Sie sie in markierte Aluminiumfolie für die sofortige Analyse. Für die langfristige Lagerung, lyophilisieren Sie die Wurzeln in flüssigem Stickstoff und legen Sie die Wurzeln bei minus 80 Grad Celsius bis zu ihrer Untersuchung.
Nach der genetischen Transformation und Kultur, wie gezeigt, werden die haarigen Wurzeln eine flauschige weiße Farbe und eine plagiotrope Weise in den Wundstellen der Expflanzen aufweisen und eine stark verzweigte und verzahnte Matrix bilden. Ein Reportergen kann verwendet werden, um die Differenzierung der transgenen haarigen Wurzeln unter einer blauen oder leichten dualen ultravioletten Transillumination oder die Identifizierung eines Zielgens von Interesse zu erleichtern. Hierwird wird die relative Expression eines lichtinduzierten Transkriptionsfaktors in den transgenen Linien von tartären Buchweizenhaarwurzeln gezeigt.
Insbesondere wird die Biosynthese von Rutin und Quercetin auch auf metabolischer Ebene als Reaktion auf den induzierten Transkriptionsfaktor Überexpression gefördert. Darüber hinaus ist die relative Genexpression von Flavenoid-Synthesesignalgenen in allen drei transgenen Linien bemerkenswert höher als die in der Kontrollgruppe gemessenen, was auf eine erfolgreiche haarige Wurzeltransformation in herbaren Buchweizenexplanten hindeutet. Das ist Infektion der Samen, Selektion der Expflanzen, und die Konzentration der Bakterien direkt beeinflussen den Erfolg der haarigen Wurzelinduktion.
Wir können die Genexpression, DNA-Protein- oder Proteinproteinreaktionen oder die Massenproduktion von sekundären Metaboliten bewerten, um sekundäre Metaboliten der Transkriptionsregulation zu untersuchen. Die konstruierten Bakterien sind gefährlich für Mensch und Umwelt. Achten Sie darauf, die Bakterien richtig zu behandeln, zu bedienen und zu entsorgen.
