Dieses Protokoll ist wichtig, weil es Wissenschaftlern ermöglicht, eine einfache genetische Analyse von bakteriellen Wilkerkrankungen in Tomaten durchzuführen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Manipulation der Genexpression und nachfolgende Assays in kurzer Zeit und mit den geringen Anforderungen an Ausrüstung und Pflanzenwachstumsraum durchgeführt werden können. Dies ist Methode ist sehr vielseitig, und es kann auf andere Pflanzen angewendet werden, um sowohl Pathogen-Impfung und andere physiologische Assays durchzuführen.
Um die Sterilität während der Manipulation von Sämlingen in vitro zu erhalten, ist es wichtig, die Platten geschlossen zu halten, wenn sie außerhalb der Durchflusshaube sind. Dies ist eine einfache Technik, aber es erfordert mehrere Schritte für die Manipulation. Die Visualisierung dieser Methode wird helfen, kleine Tricks zu sehen, die im Manuskript schwer zu erklären sind, und anderen Forschern helfen, die Methode in ihren Labors umzusetzen.
Um dieses Verfahren zu demonstrieren, wird Achen Zhao, ein Student, helfen. Nach dem Sterilisieren und Waschen der Tomatensamen auf halbfeste Murashige und Skoog Medium ohne Saccharose übertragen. Halten Sie die Samen drei Tage lang bei einer Temperatur zwischen 25 und 28 Grad Celsius im Dunkeln.
Stellen Sie autoklavierte 8,5-Quadrat-Zentimeter-Filter in neun Quadratzentimeter Petrischalen mit halbfesten Murashige- und Skoog-Mittel und legen Sie sechs gekeimte Tomatensamen auf jeden Teller. Versiegeln Sie die Platte mit Micropore-Band, und bebrüten Die gekeimten Samen bei 25 bis 28 Grad Celsius für drei bis vier Tage. Wachsen Sie das Agrobacterium rhizogenes MSU440 in festem LB Medium mit geeigneten Antibiotika für zwei Tage bei 28 Grad Celsius vor der Pflanzentransformation.
Schneiden Sie mit einem sterilen Skalpell den Radikel und den Boden des Hypocotyls der Tomatensämlinge. Verwenden Sie Plastikspitzen oder eine Skalpellklinge, um A.rhizogenes Biomasse von der Oberfläche des LB-Mediums zu ernten, und tauchen Sie die geschnittenen Tomatensämlinge vorsichtig in die bakterielle Biomasse. Danach die Tomatensämlinge mit einem halbkreisförmigen Filterpapier von zwei Zentimetern und vier Zentimetern bedecken, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu halten und das Überleben und die Entwicklung neuer Wurzeln zu erleichtern.
Es ist wichtig, die Sämlinge in einer Umgebung zu halten, die Transpiration ermöglicht. Um dies zu tun, decken Sie die Sämlinge mit Filterpapier, und schließen Sie die Platte mit Micropore-Band. Bewahren Sie die transformierten Tomatensämlinge sechs bis sieben Tage in einer Wachstumskammer bei einer Temperatur zwischen 25 und 28 Grad Celsius auf.
Dann verwenden Sie ein steriles Skalpell, um die neu entstehenden haarigen Wurzeln zu schneiden, und lassen Sie die Sämlinge neue haarige Wurzeln zu produzieren. Sobald die zweite Generation der neuen haarigen Wurzeln erscheint, entfernen Sie das Filterpapier auf den Sämlingen und versiegeln Sie die Platte wieder mit Micropore-Band. Um DsRed Fluoreszenz oder andere Geräte für die Pflanzen-in-vivo-Bildgebung zu visualisieren, markieren Sie die positiven transformierten Wurzeln, die durch die rote Fluoreszenz identifiziert werden können.
Verwenden Sie ein Skalpell, um die negativen nicht transformierten Wurzeln zu entfernen, die durch ihren Mangel an roter Fluoreszenz identifiziert werden können. Übertragen Sie die Sämlinge, die rote Fluoreszenz zeigen, auf eine neue Platte, die halbfeste Murashige- und Skoog-Mittel enthält, um die Entwicklung der transformierten Wurzel als Hauptwurzel zu erleichtern. Bewahren Sie die Sämlinge, die keine rote Fluoreszenz zeigen, in derselben Platte auf, um die Entstehung fluoreszierender Wurzeln in späteren Zeitpunkten zu überprüfen.
Bedecken Sie die Sämlinge mit einem zwei Zentimeter mal vier Zentimeter großen Halbkreisfilterpapier, versiegeln Sie die Platte und bebrüten die Sämlinge, damit sie neue haarige Wurzeln entwickeln können. Bereiten Sie die Impftöpfe vor, in denen die Oberfläche der Wurzeln dem bakteriellen Inokulum ausgesetzt wird, indem Sie zuerst die Impftöpfe mit Wasser einweichen, überschüssiges Wasser abgießen und dann in eine Kunststoff-Pflanzschale legen. Übertragen Sie die ausgewählten Sämlinge mit transformierten Wurzeln mit einer Pinzette in die Impftöpfe.
Bedecken Sie das Fach mit Plastikfolie oder einem transparenten Deckel und halten Sie es bei 25 bis 28 Grad Celsius bei 65 % Luftfeuchtigkeit. Entfernen Sie die Abdeckung nach fünf oder sechs Tagen. Wachsen Ralstonia in fünf LB flüssigen Medium in einem Orbital-Shaker bei 28 Grad Celsius, mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute, bis zur stationären Phase.
Messen Sie die optische Dichte mit 600 Nanometern, um die Bakterienzahlen zu bestimmen. Verdünnen Sie die Bakterienkultur mit Wasser auf eine OD600 von 1. 16 bis 20 Impftöpfe, die transformierte Tomatenpflanzen enthalten, in eine Impfschale geben.
Dann gießen Sie 300 Milliliter verdünntes bakterielles Inokulum in die Schale, und lassen Sie die Pflanzen in das Inokulum für 20 Minuten einweichen. Danach bereiten Sie ein neues Tablett mit einer Schicht Von Blumenerde. Bewegen Sie die geimpften Töpfe in das neue Tablett, und legen Sie die Schalen in eine Wachstumskammer mit 75% Luftfeuchtigkeit, einer Temperatur zwischen 26 und 28 Grad Celsius und einer Photoperiode von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit.
Hier werden Tomatenwurzeln transformiert und mit Ralstonie geimpft, um eine einfache genetische Analyse für die Untersuchung der bakteriellen Wilt-Krankheit durchzuführen. Die Entwicklung von Krankheitssymptomen wird in Tomatenpflanzen mit Wurzeln verfolgt, die mit einem leeren Vektor transformiert wurden, und solchen, die mit einem RAI-Konstrukt transformiert werden, das auf Dietor CESA6 abzielt. Die Krankheitsindexdaten werden im Laufe der Zeit von derselben versuchsweise Einheit nach einer beliebigen Skala von null bis vier gesammelt und folgen nicht einer Gaußschen Verteilung, was die Verwendung von Standardtests für parametrische Daten ausschließt.
Als Standardansatz wird ein U Mann-Whitney, zweischwanzig, nicht-parametrischer Test verwendet, um sowohl die Kontroll- als auch die Infektionskurven zu vergleichen. Nach dieser Analyse scheint der Unterschied zwischen den Medianen beider Kurven nicht signifikant zu sein. Es ist auch möglich, das Gebiet unter der Krankheitsfortschrittskurve zu quantifizieren, was es ermöglicht, mehrere Beobachtungen des Krankheitsfortschritts in einem einzigen Wert zu kombinieren.
Das Gebiet unter der Krankheitsfortschrittskurve zeigt einen höheren Wert für Kontrollpflanzen im Vergleich zu Tomaten CESA6 RNAi-Pflanzen am Ende des Infektionsprozesses, was darauf hindeutet, dass Tomaten CESA6-stillgelegte Pflanzen resistenter gegen Ralstonia-Infektionen sind als Kontrollpflanzen. Konfidenzintervalle bieten eine Möglichkeit, mit hoher Wahrscheinlichkeit einen Wertebereich zu schätzen, in dem der Grundgesamtheitswert einer gegebenen Variablen gefunden wird. Wie hier zu sehen, schätzt der Bereich des 95%-Konfidenzintervalls für die Kontroll- und Infektionskurven eine höhere Widerstandswahrscheinlichkeit, wenn CESA6 zum Schweigen gebracht wird.
Krankheitsindexwerte können in binäre Daten umgewandelt werden, wobei ein Krankheitsindex niedriger als zwei, der Null entspricht, und ein Krankheitsindex gleich oder höher als zwei, der einem entspricht. Dies ermöglicht die Darstellung einer Überlebenskurve nach der Ralstonia-Impfung. Die Unterschiede in der Überlebensrate zwischen der Kontrolle und den infizierten Pflanzen sind nach dem statistischen Test Gehan-Breslow-Wilcoxon statistisch nicht signifikant.
Die Expression von CESA6 wird dann in zwei zufällig ausgewählten transformierten Wurzeln vor dem Impfschritt analysiert, was zeigt, dass die erhöhte Resistenz gegen Ralstonie mit der reduzierten Expression von CESA6 korreliert. Nach zwei Auswahlrunden kann eine Transformationsrate von 35 bis 40% erreicht werden, und dieser Wert kann durch die Durchführung zusätzlicher Auswahlrunden erhöht werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Sämlinge mit einem Stück Filterpapier bedeckt zu halten, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten und die Platten mit Micropore zu versiegeln, um den Gasaustausch zu gewährleisten.
Nach der Wurzeltransformation können viele der Behandlungen angewendet werden, um die Pflanzenreaktion durch Beobachtung der Wurzelphysiologie oder mit Molekularbiologie, Zellbiologie oder Biochemie zu untersuchen. Hauptsächlich wird diese Technik Forschern mit begrenzten Ressourcen ermöglichen, genetische Analysen von bakteriellen Infektionen in Tomatenwurzeln durchzuführen.
