Die Messung von reaktiven Sauerstoffspezies oder ROS ist notorisch problematisch. In diesem Video zeigen wir die reproduzierbare Messung von ROS als Reaktion auf die FC-Gamma-Rezeptorvernetzung mit Fluoreszenzsonden und Durchflusszytometrie. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Reproduzierbarkeit des Assays und die Verwendung dieser Methode mit spezifischen antigenen Reizen, nicht nur Mitogenen oder bekannten ROS-Induktoren.
Dysregulierte ROS-Produktion ist zentral für die Entwicklung vieler Krankheiten wie chronische granulomatäre Krankheit oder CGD. Die genaue Messung von ROS könnte einen Teil der molekularen Diagnose von CGD darstellen. Das Studium der FC-vermittelten ROS-Produktion ist wichtig für die Untersuchung von Immundefekten wie CGD, aber auch bei der Untersuchung von Autoimmunerkrankungen oder neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen zu viel ROS zu oxidativem Stress und Entzündungen führt.
Der Zeitpunkt des Assays ist entscheidend. Ich würde jemandem raten, dieses Protokoll zum ersten Mal auszuprobieren, um gründlich vorzubereiten und, wenn möglich, ein Scheinexperiment durchzuführen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Schritte des Tests zu betonen, die besondere Aufmerksamkeit erfordern, wie z. B. das Timing des Tests.
Bereiten Sie zunächst knochen-marrow-abgeleitete Makrophagen mit konditionierten Medien vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Nach dem Grundieren der Makrophagen über Nacht, aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Serum verhungert die Zellen, indem es Medien durch das gleiche Volumen von DMEM mit niedrigem Serum ersetzt.
Für jede Maus wird eine Platte mit Anti-BSA IgG1 behandelt, während Serum verhungert, während die andere unbehandelt bleibt. Fügen Sie den unbehandelten Platten nur dmEM mit niedrigem Serum hinzu und fügen Sie den behandelten Platten DMEM mit einem Niedrigen umserlegen, das 2,5 Mikrogramm pro Milliliter murinem Anti-BSA-IgG1 enthält. Stellen Sie sicher, dass Sie für jedes Experiment eine zusätzliche unbehandelte Platte enthalten, um als zytometrische Kompensationssteuerung der Durchflusszytometrie zu fungieren.
Inkubieren Sie die Platten vier Stunden bei 37 Grad Celsius, 5% CO2. Bereiten Sie während der vierstündigen Inkubation eine 2-fache Lösung der reaktiven Sauerstoffsonden vor. Für je 10 Milliliter DMEM mit niedrigem Serum hinzufügen, vier Mikroliter eines oxidativen Stressdemittentones und vier Mikroliter eines Superoxid-Detektionsreagenzes.
Bereiten Sie dann die 2X-Sondenlösungen vor, die nur das oxidative Stressdeagenz oder nur das Superoxid-Detektionsreagenz enthalten. Nach der vierstündigen Inkubation ernten Sie die Zellen, indem Sie die Platten vorsichtig kratzen und in beschrifteten, fünf Milliliter runden Röhren sammeln. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 750 mal g für fünf Minuten.
Achten Sie darauf, zu verfolgen, welche Zellen mit murinen Anti-BSA IgG1 behandelt wurden. Als nächstes waschen Sie die Zellpellets mit zwei MilliliterPBS, um alle verbleibenden Anti-BSA aus den behandelten Zellen loszuwerden. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 750 mal g für fünf Minuten.
Dann die PBS ansaugen und das Zellpellet in 600 Mikroliter n-Low-Serum DMEM wieder aufhängen. Von der 600-Mikroliter-Zellsuspension werden 200 Mikroliter in die voretikettierten Fünf-Milliliter-Rundbodenröhren einfließen. Nehmen Sie aus den unbehandelten Zellen 200 Mikroliter für die unstimulierten Röhren, 200 Mikroliter für die als positiv bezeichneten Rohre und 200 Mikroliter für die als positiv bezeichneten Rohre plus Inhibitor.
Dann, von den Anti-BSA IgG1 behandelten Zellen, nehmen Sie 200 Mikroliter für Röhren mit der Bezeichnung FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung, und 200 Mikroliter für Röhren mit der Bezeichnung FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung plus Inhibitor. Nehmen Sie aus den unbehandelten Zellen, die für Kompensationskontrollen verwendet werden sollen, 200 Mikroliter für die tube, die ungefärbt unstimuliert markiert ist, 200 Mikroliter für die grüne Plus-Induktor-Kontrolle und 200 Mikroliter für die Orange-Plus-Induktorkontrolle. Bereiten Sie eine 2X positive Induktorlösung vor, indem Sie das Pyocyanin ein bis 100 in jede der 2X-Sondenlösungen auf eine Konzentration von 500 Mikromolar verdünnen.
Bereiten Sie dann eine 2X BSA-Lösung vor, indem Sie die BSA-Lagerlösung in der 2X-Sondenlösung verdünnen, um eine 2-fache Konzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Bevor Sie mit der spezifischen Stimulation beginnen, wie z. B. FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung, stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien und Zellen bereit sind und legen Sie die Röhren in der Reihenfolge auf Eis, in der sie stimuliert werden. Beachten Sie bei Durchflusszytometern mit einem Autosampler die Zeit, die das Zytometer benötigt, um eine Probe zu analysieren, und fahren Sie mit der nächsten fort.
Achten Sie darauf, alle Misch- und Sondenwaschschritte einzuschließen. Das Timing ist für diesen Test sehr wichtig. Damit jeder Zustand gut kontrolliert werden kann, muss die Stimulation in genau 30 Minuten für jede Bedingung durchgeführt werden.
Stimulieren Sie die Zellen in der Reihenfolge und integrieren Sie die Verzögerungszeit zwischen den Probenerfassungen durch das Durchflusszytometer. Wenn Sie an dieser Stelle eine manuelle Kompensation durchführen, stimulieren Sie die zur Kompensation zu verwendenden Steuerrohre, indem Sie 200 Mikroliter der 2X-Sondenlösung, die das oxidative Spannungsdeagereagenz und den Induktor enthält, in die grün gekennzeichneten Rohre plus Induktor hinzufügen. Fügen Sie dann 200 Mikroliter 2X-Sondenlösung, die das Superoxid-Detektionsreagenz und den Induktor enthält, in die orange plus induktormarkierten Rohre ein.
Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten im Dunkeln. Generieren und beschriften Sie mit der Flow-Zytometrie-Software drei Beispieldateien für die Steuerung, ungefärbt, unbehandelt, den grünen Plus-Induktor und die orangen plus-Induktor-Proben, und stellen Sie sicher, dass die Kanäle und Parameter analysiert werden. Geben Sie auch die gewünschten Stoppbedingungen ein.
Nachdem die Kontrollproben eingerichtet wurden, generieren und beschriften Sie einen ähnlichen Satz von Dateien für die experimentellen Proben. Führen Sie nun die ungefärbte, unbehandelte Probe aus. Öffnen Sie ein Punktdiagramm für vorwärts streuen auf der X-Achse versus Seitenstreuung auf der Y-Achse und zeichnen Sie ein Tor um die Interessenszellen, ohne abgestorbene Zellen und Trümmer.
Verwenden Sie als Nächstes das Tor dieser Zelle, um ein weiteres Punktdiagramm des ersten Fluoreszenzmarkers FL1 auf der X-Achse im Vergleich zum zweiten Fluoreszenzmarker FL2 auf der Y-Achse zu öffnen. Zeichnen Sie ein erstes Quadrantentor, und passen Sie dann das Quadrantentor so an, dass die Ereignisse auf dem unteren linken Quadranten des FL1-gegen-FL2-Plots angezeigt werden. Führen Sie nach Abschluss der Grünen-Plus-Induktorprobe aus.
Passen Sie die Spannung so an, dass die Ereignisse auf den unteren linken und rechten Quadranten des FL1-gegen-FL2-Plots angezeigt werden. Wenden Sie diese Kompensationsmatrix dann auf alle drei Beispieldateien an. Führen Sie nun die Orange Plus Induktorprobe aus.
Passen Sie die Spannung so an, dass die Ereignisse auf den oberen und unteren linken Quadranten des FL1-/FL2-Plots angezeigt werden, und wenden Sie diese Kompensationsmatrix dann auf alle drei Beispieldateien an. Überprüfen Sie jede Kompensationsdatei, und stellen Sie sicher, dass ungefärbte, unbehandelte Ereignisse auf dem unteren linken Quadranten, die grünen Plus-Induktorereignisse auf den unteren linken und rechten Quadranten und die orangefarbenen Plus-Induktorereignisse auf den oberen und unteren linken Quadranten des FL1-/FL2-Plots angezeigt werden. Wenden Sie dann die Kompensationsmatrix auf alle experimentellen Beispieldateien an.
Sobald eine manuelle Kompensation durchgeführt und eine experimentelle Vorlage erhalten wurde, fahren Sie mit den experimentellen Proben fort. Vor der Behandlung der Zellen mit einem positiven Induktor oder der Durchführung der FC-Gamma-Rezeptor-Zellstimulation markieren Sie, welche Röhren einen ROS-Hemmer erhalten. Behandeln Sie diese Zellen mit dem ROS-Hemmer mindestens 30 Minuten vor dem positiven Induktor oder FC-Gamma-Rezeptor Stimulation durch Zugabe eines Mikroliters des Inhibitors zu 200 Mikroliter resuspendierten Zellen für eine Endkonzentration von fünf Millimolar.
Für nicht stimulierte Zellen behandeln Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern der 2X-Sondenlösung, ohne dass den 200 Mikrolitern der zellsuspensionmarkierten, unstimulierten Zellsuspension ein Stimulus zugesetzt wird. Für positive Kontrollen, behandeln Sie die Zellen mit 200 Mikroliter der 2X positive Induktorlösung zu 200 Mikroliter n-Zellsuspension markiert positive Induktor oder positive Induktor plus Inhibitor. Schließlich, für Zellen durch FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung stimuliert, behandeln sie mit 200 Mikroliter der 2X BSA-Lösung zu 200 Mikroliter der Zellsuspension mit der Bezeichnung FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung oder FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung plus Inhibitor.
Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten im Dunkeln. Analysieren Sie nach der Inkubation die Proben in der Reihenfolge, in der sie stimuliert wurden, indem Sie das Durchflusszytometer und die Analysevorlagen verwenden, die während der ersten Kompensationsschritte generiert wurden. Die hier gezeigten Daten zeigen den zytometrischen Durchfluss der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, die sich aus der Stimulation von Makrophagen durch den FC-Gamma-Rezeptor ergibt.
Es gibt einen deutlichen Anstieg der FL1- und FL2-Fluoreszenz, wenn Zellen mit FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzungsmittel stimuliert werden. Wenn Zellen vor der FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung mit dem reaktiven Sauerstoffspezies-Inhibitor behandelt wurden, wird diese erhöhte Fluoreszenz wieder auf Basalspiegel gebracht. Im Gegensatz dazu stellen diese Punktdiagramme ein erfolgloses Experiment dar, bei dem eine suboptimale reaktive Sauerstoffspezies als Ergebnis der FC-Gamma-Rezeptorstimulation beobachtet wurde.
Um die großen Unterschiede zwischen den erwarteten Prozentsätzen oder MFI-Erhöhungen hervorzuheben, zeigen diese Daten, wie Stichproben mit einem minimalen Anstieg der FL1- und FL2-Fluoreszenz aussehen. Das aktuelle Protokoll verwendet einen 24-Stunden-Grundierungsschritt. Beim Vergleich einer 24-Stunden-Grundierungszeit von 24 Stunden gab es keinen deutlichen Unterschied im Anteil der Zellen, die für das grüne oxidative Stressreagenz positiv waren.
Jedoch, Erhöhung der Grundierzeit auf 48 Stunden hat den Prozentsatz der Zellen positiv für die orange Fluoreszenz erhöht. Die wichtigsten Dinge, die Sie sich bei der Durchführung dieses Verfahrens merken sollten, sind die vorausfahrende Planung und die konsistente Übereinstimmung über den Zeitpunkt des Assays, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.
