Dieses Protokoll bietet die Herstellung einer Arbeitslösung von Granulaten für In-vivo-Studien sowie die Herstellung von granulathaltigem Serum für In-vitro-Experimente. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass die Methode aufgrund der geringen Kosten der Materialien und der Tiere, die Sie für die Experimente erstellen, leicht wiederholt werden kann. Beginnen Sie mit dem Hinzufügen von acht, 16 und 24 Gramm Gushukang, oder GSK, Granulat zu einzelnen 50-Milliliter-Röhren.
Fügen Sie 48 Milliliter Wasser in jedes Rohr, und schütteln Sie die Rohre, um das Granulat vollständig aufzulösen. Dann 1,6 Tabletten Calciumcarbonat, ergänzt mit Vitamin D3, in eine weitere 50-Milliliter-Röhre geben und die Tabletten in 48 Milliliter Saline mit Schütteln auflösen. Für die intragastrische Verabreichung der Lösungen, zunächst sanft, aber fest manuell eine ein Monatige alte, weibliche, C57 Black 6 Maus für zwei bis drei Minuten zurückhalten.
Wenn die Maus beruhigt ist, laden Sie eine 40-Millimeter-, Nummer 12-Gavage-Nadel mit 0,24 Millilitern einer Arbeitslösung von GSK-Granulat, und legen Sie die Gavage-Nadel in die Maus durch eine Seite des Mundes, bis der Nadelwiderstand gefühlt wird, was darauf hindeutet, dass die Nadel den Magen erreicht hat. Injizieren Sie das gesamte Volumen der Arbeitslösung in das Tier. Ziehen Sie dann die Gavage-Nadel zurück und geben Sie die Maus in ihren Käfig zurück, während den anderen Mäusen GSK verabreicht wird, bevor sie 0,24 Milliliter Calciumcarbonat und Vitamin-D3-Lösung auf die gleiche Weise in jede Maus injizieren.
Für GSK-haltige Blutserum-Sammlung, nach der Lieferung der entsprechenden Konzentrationen von GSK an eine Ratte durch Gavage, wie gerade gezeigt, bestätigen sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen eine Stunde nach der letzten GSK-Granulat-Verabreichung. Machen Sie eine Bauchhaut und Peritonealschnitt, und setzen Sie den Bauch auf dem Boden des Thorax. Verwenden Sie Tissue-Papier, um das Bindegewebe der Bauchaorta zu entfernen, um das Gefäß deutlich zu belichten, und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 22-Spur-Nadel ausgestattet ist, um Blut aus der Aorta zu ziehen.
Übertragen Sie das Blut in eine sterile 15-Milliliter-Röhre und stellen Sie die Röhre bei Raumtemperatur 30 bis 60 Minuten aufrecht. Wenn das Blut geklont ist, zentrifugieren Sie das Rohr, um das Serum zu trennen, und übertragen Sie das gesamte Serum für bis zu sechs Ratten in eine neue 50-Milliliter-Röhre. Schütteln Sie das Rohr, um die Sera zu mischen, bevor Sie die Serumkomponenten in einem 56-Grad-Celsius-Wasserbad für 30 Minuten inaktivieren.
Filtern Sie dann das Serum durch einen hydrophilen Polyethersulfon-Spritzenfilter in Größe von 0,22 Mikrometer poregröße, um es bis zu einem Jahr bei minus 80 Grad Celsius zu lagern. Bei der In-vitro-Osteoclastogenese die drei Dosierungen von GSK-haltigem Serum im Verhältnis eins zu vier mit einem minimalen Eagle-Medium, ergänzt durch L-Glutamin, Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside, verdünnen. Fügen Sie 200 Mikroliter jeder Verdünnung zu jedem Brunnen einer Knochenmarkmakrophagenkultur in einer 96-Well-Platte hinzu.
Dann initiieren Osteoklast-Generation durch Stimulierung jeder Brunnen mit Makrophagen Kolonie-stimulierenden Faktor und Rezeptor-Aktivator für Kernfaktor-Kappa B Liganden. Für die In-vitro-Osteoblastogenese fügen Sie jedem Brunnen einer 24-Well-Platte mesenchymalen Stammzellkultur zwei Milliliter verdünntes GSK-haltiges Serum hinzu. Die Ergebnisse des Mikrocomputertomographie-Scans deuten darauf hin, dass eialisierte Mäuse im Vergleich zu Saline-Kontrollmäusen einen signifikanten Knochenverlust zeigen.
Intervention mit 90 Tagen GSK-Granulatbehandlung erhöht die Knochenmarkdichte erheblich, insbesondere bei mit mittlerer Dosis behandelten GSK-behandelten Tieren. Die GSK-Granulatbehandlung führt auch zu einer erhöhten Trabekularknochenzahl, Knochenvolumen über das Gesamtvolumen und trabekuläre Knochendicke, aber zu einer verringerten Knochentrennung. Tartrate-resistente Säurephosphatase, oder TRAP, Färbung zeigt eine Zunahme der Anzahl der Osteoklasten in ovariectomisierten Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren, während GSK-Granulatbehandlungen TRAP-positive Osteoklastdifferenzierung im Vergleich zu den ovariectomisierten Tieren verringern.
GSK-Granulat-haltiges Serum reduziert auch die Anzahl der TRAP-positiven Osteoklasten im Vergleich zu Serum, das von Kontrolltieren gesammelt wurde. Das erfolgreiche Eindringen der Nadel in die Bauchaorta ist entscheidend, um sicherzustellen, dass von jeder Ratte ein ausreichend volumenreiches Blut geerntet wird. Eine erfolgreiche Ausführung dieser Methode sollte die Ansammlung von 15 bis 20 MillimeterBlut zuteilen, genug Material, um für In-vitro-Experimente verwendet werden.
