Die Proteinsynthese ist fehleranfällig. Fehler können jedoch unter physiologischem Stress adaptiv sein. Wir haben bereits gezeigt, dass spezifische Übersetzungsfehler in Mycobacterium zur Antibiotikatoleranz beigetragen haben.
Die Möglichkeit, bestimmte Fehlerraten zu messen, ermöglicht es uns, diesen bakterienadaptiven Mechanismus ins Visier zu nehmen. Die Hauptvorteile dieser Techniken sind, dass die Gain-of-Funktion-Reporter bei der Messung kleiner Fehlerraten, die durch Massenspektrometrie nicht leicht zu erkennen sind, exquisit sensibel sein können. Der Nluc/GFP-Assay ermöglicht das Mitteldurchsatz-Screening, da er eine übermäßige Handhabung und Lyse der Bakterien vermeidet.
Demonstriert wird das Verfahren von Doktorand Yue-Meng Chen. Heute werden wir das Verfahren der Verwendung dieser beiden Reporter durch dieses Video demonstrieren. Zunächst impfen Sie zwei Milliliter 7H9 Medium mit wildtypigen und mutierten mykobakteriellen Reporterstämmen.
Schütteln Sie bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Tage oder bis die OD bei 600 Nanometern die stationäre Phase erreicht. Aliquot und verdünnen, um eine OD bei 600 Nanometern um 0,5 bis 1 zu erhalten. Fügen Sie dann ATC zu einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter hinzu.
Fügen Sie der Kultur sofort verschiedene Dosen von ksg nach dem Manuskript hinzu, um ihre Auswirkungen auf die Fehlübersetzungsraten zu messen. Bei 37 Grad Celsius mit Schütteln vier bis sechs Stunden bebrüten. Als nächstes übertragen Sie die Bakterienkulturen auf eine Zwei-Milliliter-Röhre.
Und Zentrifuge bei 3, 220 mal g bei Raumtemperatur für fünf Minuten, um die Bakterien zu pellet. Nach dem Zentrifugationsschritt den Überstand entsorgen und die Bakterien stören, indem Sie 40 Mikroliter des 1x passiven Lysepuffers hinzufügen. Übertragen Sie das resuspendierte bakterielle Lysat auf eine weiße 96-Well-Platte, eine gut pro Probe, und schütteln Sie bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
Fügen Sie 80 Mikroliter Gallesubstrat zu jedem Brunnen hinzu. 15 Sekunden schütteln und die Lumineszenz mit einem Leuchtkraftmesser messen. Dann fügen Sie 80 Mikroliter Renilla Substrat zu jedem Brunnen.
15 Sekunden schütteln und die Leuchtkraft am Luminometer messen. Verwenden Sie die korrigierten Werte, um die Fehlübersetzungsraten jeder Bedingung zu berechnen. Zunächst impfen Sie zwei Milliliter 7H9 Medium mit dem bakteriellen Reporterstamm.
Schütteln Sie bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Tage oder bis die OD bei 600 Nanometern die stationäre Phase erreicht. Dann, Subkultur in 50 Milliliter von 7H9 medium und wachsen, bis die OD bei 600 Nanometern erreicht die späte stationäre Phase. Bevor Sie die Bakterien zu einer 96-Well-Platte aliquotieren, fügen Sie ATC mit einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter hinzu und mischen Sie sie gut.
Fügen Sie 100 Mikroliter pro Brunnen zu einer klaren, runden 96-Well-Platte hinzu. Als nächstes fügen Sie verschiedene Dosen von ksg zu ausgewählten Brunnen hinzu, um ihre Auswirkungen auf die Fehlübersetzungsraten zu überprüfen. Fügen Sie 200 Mikroliter steriles Wasser in randbrunnen der Platte hinzu, um die Verdunstung aus den Probenbrunnen zu begrenzen.
Versiegeln Sie die Platte, schütteln sie und induzieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für 16 bis 20 Stunden. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 80 Mikroliter aus jedem Brunnen zu nehmen. Übertragen Sie die Proben auf eine 96-Well-Platte mit schwarzem Boden und messen Sie das GFP-Signal am Luminometer.
Zentrifugieren Sie nach der Messung des GFP-Signals die Platte 10 Minuten lang bei 3, 220 mal g. Dann 50 Mikroliter des Überstandes auf eine 96-Well-Platte mit weißem Boden übertragen. Dann fügen Sie 50 Mikroliter Nluc Substrat zu jedem Brunnen.
Gut mischen und die Lumineszenz am Luminometer messen. Schließlich bestimmen Sie das Nluc/GFP-Verhältnis, indem Sie den korrigierten Nluc-Lumineszenzwert durch GFP-Fluoreszenz dividieren. In dieser Arbeit wurde das Renilla Firefly Reportersystem verwendet, um die Fehlübersetzungsrate in Gegenwart von Kasugamycin in Wildtyp und in einem Stamm von S.Smegmatis zu messen, die ksgA gelöscht wurde.
Die Ergebnisse zeigten eine klare dosisabhängige Art und Weise der ksg abnehmenden Fehlübersetzungsrate, während ksg im ksgA-Deletion-Stamm weniger potent war und die Ausgangsbasis der Fehlübersetzungsrate aufgrund der Resistenz gegen Modulation durch Kasugamycin höher war. Kasugamycin-Aktion auf Fehlübersetzung wurde auch mit dem Nluc/GFP-Reporter gemessen. Sowohl Renilla Firefly als auch Nluc/GFP Reporter beinhalten die Messung der Luziferase-Aktivität.
Kleine Pipettierfehler können große Schwankungen bei den Auslesungen verursachen. Zunächst einmal empfehlen wir, die Anzahl der einzelnen Replikationen zu erhöhen, um die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, dass unzuverlässige Auslesungen erhalten werden.
