Name: phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos
Uploaded: 2017-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos at JoVE.com

Wir danken Kaz Nagaosa und Akiko Shiratsuchi für ihren Rat.

1. Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung von frischen Traubensaft-Agarplatten <ol><li> 100 ml Wasser zu 4,4 g Agar geben und die Mischung in einem Mikrowellenofen erhitzen, um Agar aufzulösen. </li><li> Füge 80 ml frischen Traubensaft, 5 ml Essigsäure und 5 ml Ethanol zu Agar-Lösung hinzu. </li><li> Gießen Sie ca. 1,5 mL der Lösung mit einer Pipette auf jede Glasrutsche und lassen Sie sie verfestigen. </li></ol></li><li> Vorbereitung von 6 cm Schalen-Agarose-Platten <ol><li> Füge 50 ml Wasser zu 0,5 g Agarose hinzu und erhitze die Mischung in einem Mikrowellenofen, um Agarose aufzulösen. </li><li> Gießen Sie ca. 2,5 ml Agarose-Lösung auf eine 6 cm Schale mit einer Pipette. </li></ol></li></ol> 2. Stage 16 Embryo-Sammlung <ol><li> Sammeln Sie erwachsene Fliegen und fügen Sie 200 Frauen und 200 Männer in eine 50 ml konische Röhre. </li><li> Setzen Sie einen Teller mit frischem Traubensaft-Agar auf Hefe in die 50-ml-Röhre und schließen Sie mit einem Schwamm caP. </li><li> Inkubieren Sie die Fliegen bei 16 ° C im Licht für 2 - 3 Tage. Ändern Sie die Platte einmal pro Tag. </li><li> Die Fliegen bei 25 ° C für 1 h zur Dunkelheit bringen. </li><li> Ändern Sie die alte Platte zu einem neuen ohne Hefe. Lassen Sie Fliegen Eier für 2 Stunden legen. </li><li> Sammeln Sie die Platte und inkubieren bei 16 ° C für 26 h. </li><li> Sammle Embryos aus der Platte mit einem Pinsel in 1 ml PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100. </li><li> Waschen Sie Embryos zweimal mit 1 ml PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100. </li><li> Um das Chorion zu entfernen, füge 1,2 mL Natriumhypochloritlösung (2,2 - 3,4% Cl) zu Embryonen für 3 min hinzu. </li><li> Waschen Sie Embryos 4 mal mit 1 ml PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100. </li><li> Legen Sie Embryonen auf 6-cm-Schalen-Agarose-Platten. Hebe die Embryonen der Stufe 16 unter einem Mikroskop auf, wie von Roberts 20 beschrieben . Sammle etwa 50 Embryos in einem 1,5-mL Treff Mikro-Reagenzglas mit einer Mikropipette. </li></ol> 3. PrepaRation von embryonalen Zellen <ol><li> Waschen Sie Embryos zweimal mit 150 μl PBS. </li><li> Homogenisieren Sie Embryos 30 Mal in einem 1,5 mL Mikro-Teströhrchen und Pellet-Mischer in Gegenwart von 200 &amp; mgr; l Collagenase (0,25% (w / v)) in PBS. </li><li> Embryonale Zellen durch 10-minütiges Pipettieren dispergieren und die Zellsuspension auf ein 1,5 mL-Röhrchen bewegen. Inkubieren von Zellen bei 37 ° C für 1 min in einem Wasserbad. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Füge 800 μl PBS zur Zellsuspension hinzu und zentrifugiere bei 1400 x g bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 μl Trypsin (0,25% (w / v)) in PBS zu den Zellen hinzu. Embryonale Zellen durch mehrmaliges Pipettieren empergieren. </li><li> Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem 70 μm Zell-Sieb. </li><li> Um die Trypsin-Aktivität zu stoppen, füge 40 μl hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum zu der filtrierten Zellsuspension hinzu. Füge 800 μl PBS zu und zentrifugiere bei 1.400 x g bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Entfernen Sie die Supernatant, suspendieren für 5 min - Zellen in 200 ul PBS und Zentrifugation bei 1400 x g bei 4 ° C ausgefällt. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie ausgefällte Zellen in 30 μl PBS. </li><li> Montieren Sie die vorbereitete Zellsuspension auf Aminopropyltriethoxysilan-beschichteten Glasscheiben und warten Sie 10 - 15 min, bis die Zellen an den Glasscheiben anhaften. </li><li> Entfernen Sie die restliche Lösung auf den Glasscheiben mit einer Pipette. Montieren Sie 60 - 70 μl PBS mit 4% (w / v) PFA (Paraformaldehyd) auf Zellen für 10 - 15 min zur Fixierung. </li><li> Entfernen Sie die Fixierlösung und legen Sie Glasscheiben in PBS für mehr als 1 min. </li></ol> 4. Färbung von Hämozyten <ol><li> Immunfärbung mit einem Anti-Croquemort-Antikörper <ol><li> Die Glasscheiben in 10 Minuten in Methanol gießen, in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min und dann in PBS für 10 min. </li><li> 20 μl 5% (v / v) vollständiges Schweine-Serum in PBS enthaltenNg 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zum Blockieren. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Entfernen Sie die Lösung aus Glasscheiben und montieren Sie 20 μl Anti-Croquemort-Antiserum 19 , 21 (0,1% (v / v)) in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen. Inkubieren Sie die Objektträger bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen. </li><li> Glasscheiben in PBS für 10 min einweichen. </li><li> Mischen Sie 20 μl alkalisches Phosphatase-markiertes Anti-Ratten-IgG (0,5% (v / v)) in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 und 5% (v / v) ganzes Schweine-Serum auf Zellen im Raum Temperatur für 1 Stunde. </li><li> Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen. </li><li> Einweichen von Glasrutschen in Puffer, enthaltend 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 für 10 min. </li><li> Mount-Phosphatase-Substratlösung, enthaltend 0,23 mg / ml 5-Brom-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP), 0,35 mg / ml Nitroblau-Tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 auf Zellen. </li><li> Beobachten Sie Zellen unter einem Mikroskop für die richtige Färbung. Wenn starke lila Signale in den Granulaten der Hämocyten auftreten, entfernen Sie die Substratlösung und tränken Glasscheiben in Puffer, bestehend aus 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 und 1 mM EDTA. Färbung für ca. 5 - 10 min wird empfohlen. </li></ol></li><li> Immunfärbung mit einem Anti-GFP-Antikörper (eine weitere Option zur Färbung von Hämocyten) <ol><li> Manche Glasscheiben in Methanol für 10 min einwirken lassen, PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min und PBS für 10 min. </li><li> 20 μl von 5% (v / v) Gesamtschweine-Serum in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zum Blockieren auftragen. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Entfernen Sie die Lösung auf Glasplättchen und montieren Sie 20 μl des Maus-Anti-GFP-Antikörpers (1% (v / v)) / PBS c0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zu erhalten. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen. </li><li> Glasscheiben in PBS für 10 min einweichen. </li><li> 20 μl alkalisches Phosphatase-markiertes Anti-Maus-IgG (0,5% (v / v)) in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 und 5% (v / v) Gesamt-Schweine-Serum auf Zellen im Raum Temperatur für 1 Stunde. </li><li> Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen. </li><li> Einweichen von Glasrutschen in Puffer bestehend aus 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 für 10 min. </li><li> Montieren Sie die Phosphatase-Substratlösung, die 0,23 mg / ml BCIP, 0,35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 enthält. </li><li> Beobachten Sie Zellen unter einem Mikroskop für die richtige Färbung. Wenn lila Signale in ganzen Hämocyten auftreten, entfernen Sie die Substratlösung und tränken Sie Folien in Puffer, bestehend ausVon 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 und 1 mM EDTA. Die Färbung für ca. 10 - 15 min wird empfohlen. </li></ol></li></ol> 5. Fleck apoptotische Zellen von TUNEL <ol><li> Glasscheiben in PBS für 5 min einweichen. </li><li> Wiederholen Sie mit neuem PBS. </li><li> Mount Equilibration Puffer (siehe Material Tabelle) auf Zellen für 10 min. </li><li> Entfernen Sie die Lösung aus Glasplättchen und montieren Sie 20 &amp; mgr; l TdT-Lösung, die 5 &amp; mgr; l endständige Deoxynukleotidyltransferase und 15 &amp; mgr; l Reaktionspuffer auf Zellen bei 37 ° C für 1 h enthält. </li><li> Die Lösung aus den Glasscheiben entfernen und die Objektträger in Puffer aus 0,5 ml STOP / Waschpuffer und 17 ml Wasser einweichen. </li><li> Läuft in PBS für 5 min 3 mal ein. </li><li> 20 μl Anti-Digoxigenin-Peroxidase auf Zellen bei Raumtemperatur für 30 min auftragen. </li><li> Glasscheiben in PBS für 5 min 4 mal einweichen. </li><li> Einweichen von Glasscheiben in Peroxidase-Substratlösung, bestehend aus 30 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 enthaltendGa vollständiger Mikrospatel aus 3,3&#39;-Diaminobenzidintetrahydrichlorid (DAB) und 0,002% (v / v) H 2 O 2 für 30 s. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.9, bis apoptotische Zellen braun gefärbt sind. Einweichen Glas gleitet in Wasser, um die Peroxidase-Reaktion zu stoppen. </li><li> Enthält Zellen mit Wasser zur Beobachtung. </li></ol> 6. Messen Sie den Grad der Phagozytose von apoptotischen Zellen <ol><li> Beobachten Sie Proben unter einem Lichtmikroskop, um das Niveau der Phagozytose zu beurteilen. Graf Croquemort-positive Zellen oder GFP-positive Zellen als Hämocyten, TUNEL-positive Zellen als apoptotische Zellen und doppelte positive Zellen als phagozytierende Hämocyten. </li><li> Der phagozytische Index ist definiert als die Anzahl der doppelten positiven Zellen zur Gesamtzahl der Croquemort-positiven Zellen oder GFP-positiven Zellen. Es wird empfohlen, dass mehr als 300 Hämocyten beobachtet werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

<html> Wir haben hierin einen Phagozytose-Assay unter Verwendung von Drosophila- Embryonen beschrieben. Durch die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen zur quantitativen Messung der Phagozytose werden Hämocyten, Drosophila- Profi-Phagozyten für den Hämocytenmarker Croquemort oder srpHemo- getriebenen GFP immunostainiert und apoptotische Zellen werden von TUNEL in diesem Protokoll nachgewiesen. Der Grad der Phagozytose wird als phagozytischer Index ausgedrückt, indem die G...

In Metazoan-Tieren, z. B. die Nematoden Caenorhabditis elegans , die Fruchtfliege Drosophila melanogaster und Mäuse und Menschen, eine große Anzahl von Zellen unterziehen Apoptose während der Entwicklung, um ihre Körper und im Erwachsenenalter zu pflegen Homöostase 1 , 2 . Apoptotische Zellen müssen schnell entfernt werden, weil sie eine Entzündung in den umliegenden Geweben durch Freisetzung von immunogenen intrazellulären Materialien induzieren, wenn sie nicht vollständig entfernt werden 3 . Um die schnelle Entfernung zu erleichtern, stellen apoptotische Zellen so genannte eat-me-Signale dar, die von den Engulfierungsrezeptoren von Phagozyten erkannt werden und durch Phagozytose 3 , 4 , 5 , 6 eliminiert werden. So spielt die Phagozytose eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Wirtshomöostase und damit der Aufklärung des Moleküls<html> Die der Phagozytose von apoptotischen Zellen zugrunde liegen, ist von Bedeutung. Die Mechanismen , die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erscheinen evolutionär zwischen den Arten in den Nematoden, Fliegen und Mäuse 7 konserviert werden. Mehrere Phagozytose-Assays sind derzeit verfügbar, um die Verschlußung von apoptotischen Zellen in diesen Modelltieren zu beurteilen. In C. elegans werden 131 somatische Zellen während der Entwicklung einem programmierten Zelltod unterzogen, und Zellkerzen werden durch benachbarte Zellen phagozytiert, die nicht professionelle Phagozyten sind 8 . So zeigt das Zählen der Anzahl der verbleibenden Zellleichen in C. elegans den Grad der Phagozytose in vivo an . Durch die Suche nach Nematoden-Mutanten, die eine erhöhte Anzahl von toten Zellen zeigen, wurden mehrere für die Phagozytose benötigte Gene identifiziert und genetisch charakterisiert 9 , 10 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Ex-vivo- Phagozytose-Assays mit Primärkultur-Phagozyten, im allgemeinen Makrophagen, werden häufig bei Mäusen verwendet. Apoptotische Zellen werden unter Verwendung von Zelllinien wie Jurkat-Zellen hergestellt und mit primären Phagozyten vermischt. Nach einer Inkubation für mehrere Stunden werden die Gesamtzahl der Phagozyten und Verschlingungsphagozyten gezählt, um den Grad der Phagozytose zu bestimmen. Als eine ausgeklügelte Modifikation dieser Methode entwickelte die Nagata-Gruppe einen Ex-vivo- Phagozytose-Assay mit Zellen, die ein Caspase-resistentes ICAD (Inhibitor von Caspase-aktivierter DNase) exprimieren, bei dem apoptotische Zellen keine apoptotische DNA-Fragmentierung erfahren, aber die DNA wird immer noch gespalten Zellen sind phagozytiert. Wenn diese Zellen als apoptotische Targets in einem Phagozytose-Assay verwendet werden, wird nur die DNA von verschlungenen apoptotischen Zellen fragmentiert und durch TdT-vermittelte DUTP-Nick-Etikettierung (TUNEL) gefärbt. Also die leveL des apoptotischen Zellverschlusses wird durch Zählen von TUNEL-Signalen in einer Mischung von Phagozyten und apoptotischen Zellen gemessen 13 . In D. melanogaster sind professionelle Phagozyten namens Hämocyten, Drosophila Makrophagen, verantwortlich für die Phagozytose von apoptotischen Zellen 14 , 15 . Zusätzlich zu in vitro Phagozytose-Assays mit Kulturzelllinien sind in vivo Phagozytose-Assays mit ganzen Drosophila- Embryonen verfügbar. Drosophila- Embryos sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Niveau der apoptotischen Zellverschlüsselung zu untersuchen, da viele Zellen einer Apoptose unterliegen und durch die Hämocyten während der embryonalen Entwicklung phagozytiert werden 14 , 15 , 16 . Ein Beispiel für einen in vivo Phagozytose-Assay ist die Methode, die von der Gruppe des Franc entwickelt wurde. In ihrer Methode sind die Hämocyten deDurch die Immunfärbung von Peroxidasin, einem Hämozytenmarker, werden die apoptotischen Zellen unter Verwendung des Kernfarbstoffs 7-Aminoaktinomycin D in ganzen Drosophila- Embryonen gefärbt, und die Anzahl der doppelten positiven Zellen wird als ein Signal der Phagozytose 17 gezählt . Ein weiteres Beispiel für einen Phagozytose-Assay auf Embryonen basiert auf dem oben beschriebenen Konzept der Nagata-Methode; In vivo wird jedoch die Phagozytose unter Verwendung der Embryonen von dCAD ( Drosophila caspase-aktivierten DNase) Mutantenfliegen 18 , 19 ausgewertet. Diese in vivo Phagozytose-Assays sind nützlich für die direkte Beobachtung der Phagozytose in situ . Allerdings sind Schwierigkeiten mit dem Ausschluss irgendeiner möglichen Vorspannung in dem Schritt des Zählens von Phagozytosierungszellen verbunden, da es schwierig ist, alle Phagozyten und apoptotischen Zellen in ganzen Embryonen aufgrund ihrer Dicke zu beobachten. Um diese Einschränkung zu überwinden, entwickeln wirEinen neuen Phagozytose-Assay in Drosophila- Embryonen. In unserer Methode, um leicht phagozytierende Hämocyten zu zählen, werden ganze Embryos homogenisiert, um dispergierte embryonale Zellen herzustellen. Phagozyten werden durch die Immunfärbung eines Phagozytenmarkers nachgewiesen und apoptotische Zellen werden von TUNEL mit diesen dispergierten embryonalen Zellen nachgewiesen. Die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen ermöglicht es uns, in vivo Phagozytose Ebenen zu messen, als ob wir einen in vitro Phagozytose-Assay, dass genau quantifiziert das Niveau der Phagozytose durchgeführt. Alle Genotypen von Fliegen können in diesem Assay angewendet werden, wenn sie sich auf Stufe 16 der Embryos 20 entwickeln , die Entwicklungsstufe, bei der die apoptotische Zellabtrennung durch Phagozytose am häufigsten ist. Diese Methode hat den Vorteil, den Grad der Phagozytose quantitativ zu beurteilen und kann somit zur Identifizierung neuer Moleküle beitragen, die an der Phagozytose von apoptotischen Zellen in vivo beteiligt sind .

<table><tbody><tr><td>whole swine serum</td><td>MP Biomedicals</td><td>55993</td><td>For bloking</td></tr><tr><td>Treff micro test tube(easy fit)&amp;nbsp; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 4625. 9. 01</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>pellet mixer&amp;nbsp; 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 7339. 9. 03</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td><td>27250-018</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td><td>KPL</td><td>475-1612</td><td>secondary antibody for&lt;br/&gt; stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-&lt;br/&gt; 3-indolyl-phosphate</td><td>Roche</td><td>11383221001</td><td>BCIP, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>nitro blue tetrazolium</td><td>Roche</td><td>11383213001</td><td>NBT, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Anti-Croquemort antibody</td><td></td><td></td><td>described previously in Manaka &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Anti-GFP&lt;br/&gt; from mouse IgG1&amp;kappa; (clones 7.1 and 13.1)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6520</td><td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td><td>Millipore</td><td>S7100</td><td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine&lt;br/&gt; tetrahydrichloride</td><td>nacalai tesque</td><td>11009-41</td><td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table of Fly Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock center&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock ID&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Control flies, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>drpr&lt;sup&gt;&amp;Delta;5&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>drpr mutant, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>Itgbn&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Itgbn mutant, described in Devenport &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Development, 131, 5405-5415</td></tr><tr><td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td><td></td><td></td><td>described in Br&amp;uuml;ckner &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Dev. Cell., 7, 73-84</td></tr><tr><td>UAS-drpr-IR</td><td>VDRC</td><td>4833</td><td>-</td></tr><tr><td>UAS-Itgbn-IR</td><td>NIG-fly</td><td>1762R-1</td><td>-</td></tr></tbody></table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

Die molekularen Mechanismen, die der Phagozytose von apoptotischen Zellen zugrunde liegen, müssen aufgrund ihrer Rolle bei immunen und entzündlichen, nicht beherrschbaren Krankheiten genauer aufgeklärt werden. Wir haben hier eine experimentelle Methode entwickelt, um die Phagozytose quantitativ unter Verwendung der Fruchtfliege Drosophila zu untersuchen , bei der das Gennetz, das die Verschlingungsreaktionen kontrolliert, evolutionär von Säugetieren konserviert wird. Um die Phagozyten mit ganzen Tieren genau zu erfassen und zu zerlegen, wurden Drosophila- Embryos homogenisiert, um dispergierte Zellen einschließlich Phagozyten und apoptotischen Zellen zu erhalten. Die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen ermöglicht es uns, in vivo Phagozytose Ebenen zu messen, als ob wir einen in vitro Phagozytose-Assay durchgeführt haben, in dem es möglich ist, alle Phagozyten und apoptotischen Zellen in ganzen Embryonen zu beobachten und genau das Niveau der Phagozytose zu quantifizieren. Wir bestätigten, dass diese Methode die früheren Studien wiedergibtDie die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen benötigten Gene identifizierten. Diese Methode erlaubt es, die Verschlüsselung von toten Zellen zu analysieren und in Kombination mit der mächtigen Genetik von Drosophila die komplexen phagozytischen Reaktionen aufzudecken, die die Migration, die Erkennung, die Verschlußung und den Abbau von apoptotischen Zellen durch Phagozyten umfassen.

Um die Phagozytose von apoptotischen Zellen zu untersuchen, wurden Drosophila- Embryos der Entwicklungsstufe 16 gesammelt und als dispergierte Zellen hergestellt. Hemocyten, Drosophila- Makrophagen wurden durch Immunzytochemie für den Hämocytenmarker &quot;Croquemort&quot; 17 , 22 unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers 19 , 21 gefärbt und ap...

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Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Wir beschreiben hier einen Phagozytose-Assay unter Verwendung der dispergierten embryonalen Zellen von Drosophila . Es ermöglicht uns, in vivo Phagozytose Ebenen einfach und präzise zu quantifizieren und neue Moleküle zu identifizieren, die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erforderlich sind.

Phagozytose - Assay für apoptotische Zellen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

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Cell Biology

Immunology and Infection

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

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9.8K Aufrufe.  Kanazawa University.  Wir beschreiben hier einen Phagozytose-Assay unter Verwendung der dispergierten embryonalen Zellen von Drosophila . Es ermöglicht uns, in vivo Phagozytose Ebenen einfach und präzise zu quantifizieren und neue Moleküle zu identifizieren, die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erforderlich sind. 

Serie: Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Neurowissenschaften

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Medizin

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Beurteilung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, mit einem In-Vivo-Phagozytose-Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Biologie

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

An In Vivo Assay to Quantify Bacterial Phagocytosis in Adult Drosophila Flies

Source: Nazario-Toole, A. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59543">Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates an in vivo assay designed to measure bacterial phagocytosis in adult Drosophila flies. Following the injection of fluorescently labeled bacteria into the abdomen of adult flies, hemocytes associated with the dorsal vessel engage in phagocytosis. The introduction of trypan blue dye serves to quench the fluorescence emitted by extracellular, non-phagocytosed bacteria. This quenching process enhances the identification of phagocytosed bacteria when observed under a fluorescence microscope.

Ein In-vivo-Assay zur Quantifizierung der bakteriellen Phagozytose bei adulten Drosophila-Fliegen

1. Prepare Fluorescein particles for injection

	Reconstitute 10 mg of commercially available, heat-killed bacteria particles labeled with fluorescein ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

The Phagocytosis Assay: An Immunostaining Technique to Visualize Apoptotic Cell Engulfment in the Embryonic Cells of Drosophila melanogaster

Source: Nonaka, S. et al. <a href="https://app.jove.com/v/56352">Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining technique to visualize apoptotic cell engulfment in the homogenized embryonic cells of Drosophila melanogaster. This method provides insights into cellular physiology by determining the extent of apoptotic cell engulfment.

Der Phagozytose-Assay: eine Immunfärbetechnik zur Visualisierung des apoptotischen Zellengulfments in den embryonalen Zellen von Drosophila melanogaster

Source: Nonaka, S. et al. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining ...

Biological Techniques

Assay Techniques

Cell-based assays

Fixed Cell Efferocytosis Assay: A Method to Study Efferocytic Uptake of Apoptotic Cells by Macrophages Using Fluorescence Microscopy

Source: Taruc, K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58149">Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the efferocytosis assay to study the clearance of apoptotic cells using confocal microscopy. Efferocytosis is a multi-step process where apoptotic cells are engulfed by phagocytes and degraded within vesicles called efferosomes. This protocol provides a method to visualize internalized and non-internalized portions of individual apoptotic cells and quantify efferocytosis.

Fixierter Zell-Efferozytose-Assay: Eine Methode zur Untersuchung der efferozytären Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen mittels Fluoreszenzmikroskopie

Source: Taruc, K., et al. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...

Phagozytose - Assay für apoptotische Zellen in

Zusammenfassung

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