Wir danken Kaz Nagaosa und Akiko Shiratsuchi für ihren Rat.

1. Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung von frischen Traubensaft-Agarplatten <ol><li> 100 ml Wasser zu 4,4 g Agar geben und die Mischung in einem Mikrowellenofen erhitzen, um Agar aufzulösen. </li><li> Füge 80 ml frischen Traubensaft, 5 ml Essigsäure und 5 ml Ethanol zu Agar-Lösung hinzu. </li><li> Gießen Sie ca. 1,5 mL der Lösung mit einer Pipette auf jede Glasrutsche und lassen Sie sie verfestigen. </li></ol></li><li> Vorbereitung von 6 cm Schalen-Agarose-Platten <ol><li> Füge 50 ml Wasser zu 0,5 g Agarose hinzu und erhitze die Mischung in einem Mikrowellenofen, um Agarose aufzulösen. </li><li> Gießen Sie ca. 2,5 ml Agarose-Lösung auf eine 6 cm Schale mit einer Pipette. </li></ol></li></ol> 2. Stage 16 Embryo-Sammlung <ol><li> Sammeln Sie erwachsene Fliegen und fügen Sie 200 Frauen und 200 Männer in eine 50 ml konische Röhre. </li><li> Setzen Sie einen Teller mit frischem Traubensaft-Agar auf Hefe in die 50-ml-Röhre und schließen Sie mit einem Schwamm caP. </li><li> Inkubieren Sie die Fliegen bei 16 ° C im Licht für 2 - 3 Tage. Ändern Sie die Platte einmal pro Tag. </li><li> Die Fliegen bei 25 ° C für 1 h zur Dunkelheit bringen. </li><li> Ändern Sie die alte Platte zu einem neuen ohne Hefe. Lassen Sie Fliegen Eier für 2 Stunden legen. </li><li> Sammeln Sie die Platte und inkubieren bei 16 ° C für 26 h. </li><li> Sammle Embryos aus der Platte mit einem Pinsel in 1 ml PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100. </li><li> Waschen Sie Embryos zweimal mit 1 ml PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100. </li><li> Um das Chorion zu entfernen, füge 1,2 mL Natriumhypochloritlösung (2,2 - 3,4% Cl) zu Embryonen für 3 min hinzu. </li><li> Waschen Sie Embryos 4 mal mit 1 ml PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100. </li><li> Legen Sie Embryonen auf 6-cm-Schalen-Agarose-Platten. Hebe die Embryonen der Stufe 16 unter einem Mikroskop auf, wie von Roberts 20 beschrieben . Sammle etwa 50 Embryos in einem 1,5-mL Treff Mikro-Reagenzglas mit einer Mikropipette. </li></ol> 3. PrepaRation von embryonalen Zellen <ol><li> Waschen Sie Embryos zweimal mit 150 μl PBS. </li><li> Homogenisieren Sie Embryos 30 Mal in einem 1,5 mL Mikro-Teströhrchen und Pellet-Mischer in Gegenwart von 200 &amp; mgr; l Collagenase (0,25% (w / v)) in PBS. </li><li> Embryonale Zellen durch 10-minütiges Pipettieren dispergieren und die Zellsuspension auf ein 1,5 mL-Röhrchen bewegen. Inkubieren von Zellen bei 37 ° C für 1 min in einem Wasserbad. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Füge 800 μl PBS zur Zellsuspension hinzu und zentrifugiere bei 1400 x g bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 μl Trypsin (0,25% (w / v)) in PBS zu den Zellen hinzu. Embryonale Zellen durch mehrmaliges Pipettieren empergieren. </li><li> Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem 70 μm Zell-Sieb. </li><li> Um die Trypsin-Aktivität zu stoppen, füge 40 μl hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum zu der filtrierten Zellsuspension hinzu. Füge 800 μl PBS zu und zentrifugiere bei 1.400 x g bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Entfernen Sie die Supernatant, suspendieren für 5 min - Zellen in 200 ul PBS und Zentrifugation bei 1400 x g bei 4 ° C ausgefällt. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie ausgefällte Zellen in 30 μl PBS. </li><li> Montieren Sie die vorbereitete Zellsuspension auf Aminopropyltriethoxysilan-beschichteten Glasscheiben und warten Sie 10 - 15 min, bis die Zellen an den Glasscheiben anhaften. </li><li> Entfernen Sie die restliche Lösung auf den Glasscheiben mit einer Pipette. Montieren Sie 60 - 70 μl PBS mit 4% (w / v) PFA (Paraformaldehyd) auf Zellen für 10 - 15 min zur Fixierung. </li><li> Entfernen Sie die Fixierlösung und legen Sie Glasscheiben in PBS für mehr als 1 min. </li></ol> 4. Färbung von Hämozyten <ol><li> Immunfärbung mit einem Anti-Croquemort-Antikörper <ol><li> Die Glasscheiben in 10 Minuten in Methanol gießen, in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min und dann in PBS für 10 min. </li><li> 20 μl 5% (v / v) vollständiges Schweine-Serum in PBS enthaltenNg 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zum Blockieren. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Entfernen Sie die Lösung aus Glasscheiben und montieren Sie 20 μl Anti-Croquemort-Antiserum 19 , 21 (0,1% (v / v)) in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen. Inkubieren Sie die Objektträger bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen. </li><li> Glasscheiben in PBS für 10 min einweichen. </li><li> Mischen Sie 20 μl alkalisches Phosphatase-markiertes Anti-Ratten-IgG (0,5% (v / v)) in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 und 5% (v / v) ganzes Schweine-Serum auf Zellen im Raum Temperatur für 1 Stunde. </li><li> Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen. </li><li> Einweichen von Glasrutschen in Puffer, enthaltend 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 für 10 min. </li><li> Mount-Phosphatase-Substratlösung, enthaltend 0,23 mg / ml 5-Brom-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP), 0,35 mg / ml Nitroblau-Tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 auf Zellen. </li><li> Beobachten Sie Zellen unter einem Mikroskop für die richtige Färbung. Wenn starke lila Signale in den Granulaten der Hämocyten auftreten, entfernen Sie die Substratlösung und tränken Glasscheiben in Puffer, bestehend aus 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 und 1 mM EDTA. Färbung für ca. 5 - 10 min wird empfohlen. </li></ol></li><li> Immunfärbung mit einem Anti-GFP-Antikörper (eine weitere Option zur Färbung von Hämocyten) <ol><li> Manche Glasscheiben in Methanol für 10 min einwirken lassen, PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min und PBS für 10 min. </li><li> 20 μl von 5% (v / v) Gesamtschweine-Serum in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zum Blockieren auftragen. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Entfernen Sie die Lösung auf Glasplättchen und montieren Sie 20 μl des Maus-Anti-GFP-Antikörpers (1% (v / v)) / PBS c0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zu erhalten. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen. </li><li> Glasscheiben in PBS für 10 min einweichen. </li><li> 20 μl alkalisches Phosphatase-markiertes Anti-Maus-IgG (0,5% (v / v)) in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 und 5% (v / v) Gesamt-Schweine-Serum auf Zellen im Raum Temperatur für 1 Stunde. </li><li> Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen. </li><li> Einweichen von Glasrutschen in Puffer bestehend aus 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 für 10 min. </li><li> Montieren Sie die Phosphatase-Substratlösung, die 0,23 mg / ml BCIP, 0,35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 enthält. </li><li> Beobachten Sie Zellen unter einem Mikroskop für die richtige Färbung. Wenn lila Signale in ganzen Hämocyten auftreten, entfernen Sie die Substratlösung und tränken Sie Folien in Puffer, bestehend ausVon 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 und 1 mM EDTA. Die Färbung für ca. 10 - 15 min wird empfohlen. </li></ol></li></ol> 5. Fleck apoptotische Zellen von TUNEL <ol><li> Glasscheiben in PBS für 5 min einweichen. </li><li> Wiederholen Sie mit neuem PBS. </li><li> Mount Equilibration Puffer (siehe Material Tabelle) auf Zellen für 10 min. </li><li> Entfernen Sie die Lösung aus Glasplättchen und montieren Sie 20 &amp; mgr; l TdT-Lösung, die 5 &amp; mgr; l endständige Deoxynukleotidyltransferase und 15 &amp; mgr; l Reaktionspuffer auf Zellen bei 37 ° C für 1 h enthält. </li><li> Die Lösung aus den Glasscheiben entfernen und die Objektträger in Puffer aus 0,5 ml STOP / Waschpuffer und 17 ml Wasser einweichen. </li><li> Läuft in PBS für 5 min 3 mal ein. </li><li> 20 μl Anti-Digoxigenin-Peroxidase auf Zellen bei Raumtemperatur für 30 min auftragen. </li><li> Glasscheiben in PBS für 5 min 4 mal einweichen. </li><li> Einweichen von Glasscheiben in Peroxidase-Substratlösung, bestehend aus 30 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 enthaltendGa vollständiger Mikrospatel aus 3,3&#39;-Diaminobenzidintetrahydrichlorid (DAB) und 0,002% (v / v) H 2 O 2 für 30 s. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.9, bis apoptotische Zellen braun gefärbt sind. Einweichen Glas gleitet in Wasser, um die Peroxidase-Reaktion zu stoppen. </li><li> Enthält Zellen mit Wasser zur Beobachtung. </li></ol> 6. Messen Sie den Grad der Phagozytose von apoptotischen Zellen <ol><li> Beobachten Sie Proben unter einem Lichtmikroskop, um das Niveau der Phagozytose zu beurteilen. Graf Croquemort-positive Zellen oder GFP-positive Zellen als Hämocyten, TUNEL-positive Zellen als apoptotische Zellen und doppelte positive Zellen als phagozytierende Hämocyten. </li><li> Der phagozytische Index ist definiert als die Anzahl der doppelten positiven Zellen zur Gesamtzahl der Croquemort-positiven Zellen oder GFP-positiven Zellen. Es wird empfohlen, dass mehr als 300 Hämocyten beobachtet werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116 (2), 205-219 (2004).</li><li>Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+development.">Cell death in development.</a> Cell. 96 (2), 245-254 (1999).</li><li>Savill, J., Fadok, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corpse+clearance+defines+the+meaning+of+cell+death.">Corpse clearance defines the meaning of cell death.</a> Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).</li><li>Ravichandran, K. S., Lorenz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells:+signals+for+a+good+meal.">Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal.</a> Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beginnings+of+a+good+apoptotic+meal:+the+find-me+and+eat-me+signaling+pathways.">Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways.</a> Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).</li><li>Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+removal+of+cells+that+have+become+unwanted:+implications+for+animal+development+and+tissue+homeostasis.">Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis.</a> Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).</li><li>Reddien, P. W., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+engulfment+process+of+programmed+cell+death+in+caenorhabditis+elegans.">The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).</li><li>Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+programmed+cell+deaths+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).</li><li>Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+the+engulfment+of+cell+corpses+during+programmed+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).</li><li>Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CED-12/ELMO,+a+novel+member+of+the+CrkII/Dock180/Rac+pathway,+is+required+for+phagocytosis+and+cell+migration.">CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration.</a> Cell. 107 (1), 27-41 (2001).</li><li>Hsu, T. Y., Wu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells+in+C.+elegans+is+mediated+by+integrin+alpha/SRC+signaling.">Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling.</a> Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+factor+that+links+apoptotic+cells+to+phagocytes.">Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes.</a> Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).</li><li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila.">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).</li><li>Gold, K. S., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+cellular+immunity+in+Drosophila+melanogaster.">Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster.</a> Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).</li><li>Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+during+Drosophila+embryogenesis.">Programmed cell death during Drosophila embryogenesis.</a> Development. 117 (1), 29-43 (1993).</li><li>Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+croquemort+in+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).</li><li>Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+innate+immunity+in+Drosophila+by+endogenous+chromosomal+DNA+that+escaped+apoptotic+degradation.">Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation.</a> Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).</li><li>Manaka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draper-mediated+and+phosphatidylserine-independent+phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+Drosophila+hemocytes/macrophages.">Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages.</a> J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 3868-3878 (1998).</li><li>Kuraishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretaporter,+a+Drosophila+protein+serving+as+a+ligand+for+Draper+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+cells.">Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells.</a> Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).</li><li>Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Croquemort,+a+novel+Drosophila+hemocyte/macrophage+receptor+that+recognizes+apoptotic+cells.">Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells.</a> Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).</li><li>Kuraishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+calreticulin+as+a+marker+for+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).</li><li>Nagaosa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila+embryos.">Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos.</a> J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).</li><li>Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alphaPS3/betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+and+bacteria+in+Drosophila.">Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila.</a> J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).</li><li>Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NPxY+motif+in+Draper-mediated+apoptotic+cell+clearance+in+Drosophila.">Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila.</a> Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).</li><li>Bruckner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF/VEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila.">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Pathway+for+Phagocyte+Priming+upon+Encounter+with+Apoptotic+Cells.">Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells.</a> J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+disease+and+impaired+uptake+of+apoptotic+cells+in+MFG-E8-deficient+mice.">Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice.</a> Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

<html> Wir haben hierin einen Phagozytose-Assay unter Verwendung von Drosophila- Embryonen beschrieben. Durch die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen zur quantitativen Messung der Phagozytose werden Hämocyten, Drosophila- Profi-Phagozyten für den Hämocytenmarker Croquemort oder srpHemo- getriebenen GFP immunostainiert und apoptotische Zellen werden von TUNEL in diesem Protokoll nachgewiesen. Der Grad der Phagozytose wird als phagozytischer Index ausgedrückt, indem die G...

In Metazoan-Tieren, z. B. die Nematoden Caenorhabditis elegans , die Fruchtfliege Drosophila melanogaster und Mäuse und Menschen, eine große Anzahl von Zellen unterziehen Apoptose während der Entwicklung, um ihre Körper und im Erwachsenenalter zu pflegen Homöostase 1 , 2 . Apoptotische Zellen müssen schnell entfernt werden, weil sie eine Entzündung in den umliegenden Geweben durch Freisetzung von immunogenen intrazellulären Materialien induzieren, wenn sie nicht vollständig entfernt werden 3 . Um die schnelle Entfernung zu erleichtern, stellen apoptotische Zellen so genannte eat-me-Signale dar, die von den Engulfierungsrezeptoren von Phagozyten erkannt werden und durch Phagozytose 3 , 4 , 5 , 6 eliminiert werden. So spielt die Phagozytose eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Wirtshomöostase und damit der Aufklärung des Moleküls<html> Die der Phagozytose von apoptotischen Zellen zugrunde liegen, ist von Bedeutung. Die Mechanismen , die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erscheinen evolutionär zwischen den Arten in den Nematoden, Fliegen und Mäuse 7 konserviert werden. Mehrere Phagozytose-Assays sind derzeit verfügbar, um die Verschlußung von apoptotischen Zellen in diesen Modelltieren zu beurteilen. In C. elegans werden 131 somatische Zellen während der Entwicklung einem programmierten Zelltod unterzogen, und Zellkerzen werden durch benachbarte Zellen phagozytiert, die nicht professionelle Phagozyten sind 8 . So zeigt das Zählen der Anzahl der verbleibenden Zellleichen in C. elegans den Grad der Phagozytose in vivo an . Durch die Suche nach Nematoden-Mutanten, die eine erhöhte Anzahl von toten Zellen zeigen, wurden mehrere für die Phagozytose benötigte Gene identifiziert und genetisch charakterisiert 9 , 10 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Ex-vivo- Phagozytose-Assays mit Primärkultur-Phagozyten, im allgemeinen Makrophagen, werden häufig bei Mäusen verwendet. Apoptotische Zellen werden unter Verwendung von Zelllinien wie Jurkat-Zellen hergestellt und mit primären Phagozyten vermischt. Nach einer Inkubation für mehrere Stunden werden die Gesamtzahl der Phagozyten und Verschlingungsphagozyten gezählt, um den Grad der Phagozytose zu bestimmen. Als eine ausgeklügelte Modifikation dieser Methode entwickelte die Nagata-Gruppe einen Ex-vivo- Phagozytose-Assay mit Zellen, die ein Caspase-resistentes ICAD (Inhibitor von Caspase-aktivierter DNase) exprimieren, bei dem apoptotische Zellen keine apoptotische DNA-Fragmentierung erfahren, aber die DNA wird immer noch gespalten Zellen sind phagozytiert. Wenn diese Zellen als apoptotische Targets in einem Phagozytose-Assay verwendet werden, wird nur die DNA von verschlungenen apoptotischen Zellen fragmentiert und durch TdT-vermittelte DUTP-Nick-Etikettierung (TUNEL) gefärbt. Also die leveL des apoptotischen Zellverschlusses wird durch Zählen von TUNEL-Signalen in einer Mischung von Phagozyten und apoptotischen Zellen gemessen 13 . In D. melanogaster sind professionelle Phagozyten namens Hämocyten, Drosophila Makrophagen, verantwortlich für die Phagozytose von apoptotischen Zellen 14 , 15 . Zusätzlich zu in vitro Phagozytose-Assays mit Kulturzelllinien sind in vivo Phagozytose-Assays mit ganzen Drosophila- Embryonen verfügbar. Drosophila- Embryos sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Niveau der apoptotischen Zellverschlüsselung zu untersuchen, da viele Zellen einer Apoptose unterliegen und durch die Hämocyten während der embryonalen Entwicklung phagozytiert werden 14 , 15 , 16 . Ein Beispiel für einen in vivo Phagozytose-Assay ist die Methode, die von der Gruppe des Franc entwickelt wurde. In ihrer Methode sind die Hämocyten deDurch die Immunfärbung von Peroxidasin, einem Hämozytenmarker, werden die apoptotischen Zellen unter Verwendung des Kernfarbstoffs 7-Aminoaktinomycin D in ganzen Drosophila- Embryonen gefärbt, und die Anzahl der doppelten positiven Zellen wird als ein Signal der Phagozytose 17 gezählt . Ein weiteres Beispiel für einen Phagozytose-Assay auf Embryonen basiert auf dem oben beschriebenen Konzept der Nagata-Methode; In vivo wird jedoch die Phagozytose unter Verwendung der Embryonen von dCAD ( Drosophila caspase-aktivierten DNase) Mutantenfliegen 18 , 19 ausgewertet. Diese in vivo Phagozytose-Assays sind nützlich für die direkte Beobachtung der Phagozytose in situ . Allerdings sind Schwierigkeiten mit dem Ausschluss irgendeiner möglichen Vorspannung in dem Schritt des Zählens von Phagozytosierungszellen verbunden, da es schwierig ist, alle Phagozyten und apoptotischen Zellen in ganzen Embryonen aufgrund ihrer Dicke zu beobachten. Um diese Einschränkung zu überwinden, entwickeln wirEinen neuen Phagozytose-Assay in Drosophila- Embryonen. In unserer Methode, um leicht phagozytierende Hämocyten zu zählen, werden ganze Embryos homogenisiert, um dispergierte embryonale Zellen herzustellen. Phagozyten werden durch die Immunfärbung eines Phagozytenmarkers nachgewiesen und apoptotische Zellen werden von TUNEL mit diesen dispergierten embryonalen Zellen nachgewiesen. Die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen ermöglicht es uns, in vivo Phagozytose Ebenen zu messen, als ob wir einen in vitro Phagozytose-Assay, dass genau quantifiziert das Niveau der Phagozytose durchgeführt. Alle Genotypen von Fliegen können in diesem Assay angewendet werden, wenn sie sich auf Stufe 16 der Embryos 20 entwickeln , die Entwicklungsstufe, bei der die apoptotische Zellabtrennung durch Phagozytose am häufigsten ist. Diese Methode hat den Vorteil, den Grad der Phagozytose quantitativ zu beurteilen und kann somit zur Identifizierung neuer Moleküle beitragen, die an der Phagozytose von apoptotischen Zellen in vivo beteiligt sind .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>whole swine serum</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>55993</td>
			<td>For bloking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treff micro test tube(easy fit)&#160; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 4625. 9. 01</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pellet mixer&#160; 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 7339. 9. 03</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0130</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td>
			<td>27250-018</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td>
			<td>KPL</td>
			<td>475-1612</td>
			<td>secondary antibody for 
			stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro- 
			3-indolyl-phosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td>BCIP, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383213001</td>
			<td>NBT, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Croquemort antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anti-GFP 
			from mouse IgG1&#954; (clones 7.1 and 13.1)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6520</td>
			<td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S7100</td>
			<td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine 
			tetrahydrichloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>11009-41</td>
			<td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Table of Fly Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>drpr&#916;5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Itgbn2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described in Br&#252;ckner et al., Dev. Cell., 7, 73-84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-drpr-IR</td>
			<td>VDRC</td>
			<td>4833</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Itgbn-IR</td>
			<td>NIG-fly</td>
			<td>1762R-1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

Die molekularen Mechanismen, die der Phagozytose von apoptotischen Zellen zugrunde liegen, müssen aufgrund ihrer Rolle bei immunen und entzündlichen, nicht beherrschbaren Krankheiten genauer aufgeklärt werden. Wir haben hier eine experimentelle Methode entwickelt, um die Phagozytose quantitativ unter Verwendung der Fruchtfliege Drosophila zu untersuchen , bei der das Gennetz, das die Verschlingungsreaktionen kontrolliert, evolutionär von Säugetieren konserviert wird. Um die Phagozyten mit ganzen Tieren genau zu erfassen und zu zerlegen, wurden Drosophila- Embryos homogenisiert, um dispergierte Zellen einschließlich Phagozyten und apoptotischen Zellen zu erhalten. Die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen ermöglicht es uns, in vivo Phagozytose Ebenen zu messen, als ob wir einen in vitro Phagozytose-Assay durchgeführt haben, in dem es möglich ist, alle Phagozyten und apoptotischen Zellen in ganzen Embryonen zu beobachten und genau das Niveau der Phagozytose zu quantifizieren. Wir bestätigten, dass diese Methode die früheren Studien wiedergibtDie die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen benötigten Gene identifizierten. Diese Methode erlaubt es, die Verschlüsselung von toten Zellen zu analysieren und in Kombination mit der mächtigen Genetik von Drosophila die komplexen phagozytischen Reaktionen aufzudecken, die die Migration, die Erkennung, die Verschlußung und den Abbau von apoptotischen Zellen durch Phagozyten umfassen.

Um die Phagozytose von apoptotischen Zellen zu untersuchen, wurden Drosophila- Embryos der Entwicklungsstufe 16 gesammelt und als dispergierte Zellen hergestellt. Hemocyten, Drosophila- Makrophagen wurden durch Immunzytochemie für den Hämocytenmarker &quot;Croquemort&quot; 17 , 22 unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers 19 , 21 gefärbt und ap...

Watch this Scientific Journal Video about Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos at JoVE.com

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Wir beschreiben hier einen Phagozytose-Assay unter Verwendung der dispergierten embryonalen Zellen von Drosophila . Es ermöglicht uns, in vivo Phagozytose Ebenen einfach und präzise zu quantifizieren und neue Moleküle zu identifizieren, die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erforderlich sind.

Phagozytose - Assay für apoptotische Zellen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

phagocytosis-assay-for-apoptotic-cells-in-drosophila-embryos

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

9.8K Aufrufe.  Kanazawa University.  Wir beschreiben hier einen Phagozytose-Assay unter Verwendung der dispergierten embryonalen Zellen von Drosophila . Es ermöglicht uns, in vivo Phagozytose Ebenen einfach und präzise zu quantifizieren und neue Moleküle zu identifizieren, die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erforderlich sind. 

Serie: Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

Groß Reinigung von Schwein oder Rind Photorezeptoraußensegmente für Phagozytose Assays auf Netzhautpigmentepithelzellen

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Beurteilung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, mit einem In-Vivo-Phagozytose-Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...