Wir danken Dick Foley und Leigh Kimball für ihre Schlüsselrolle bei der Film-und Videoproduktion.

1. Periphere mononukleäre Zellen (PBMC) isoliert <ol><li> Besorgen Sie sich eine Blutprobe - Blut sollte in Spritzen oder Blut-Röhrchen gesammelt und anti-koaguliert mit Heparin (1:50 ratio) Gerinnen zu verhindern. Erwarten Sie eine Ausbeute von etwa 1 × 10 6 PBMC pro ml Blut - etwa 40% davon werden CD4 positive (CD4 +) T-Zellen sein. </li><li> Aliquot dem Blut in 50 ml konische Röhrchen, 25 ml pro Röhrchen. Wenn Blut getrennt hat, sanft vor Aliquotierung Mix, um das Plasma zu verteilen </li><li> Add PBS, womit das Gesamtvolumen auf 40 ml und die Unterlage durch die Erstellung von 11 ml Ficoll, Einsetzen in Blutröhrchen und sorgfältig Entfernen der Pipette Hilfe aus der Pipette. Die Ficoll wird langsam in den Boden des Röhrchens abtropfen lassen. Sobald das Niveau angeglichen hat, langsam entfernen Sie die Pipette aus dem Blutröhrchen und entsorgen. </li><li> Cap der Blut-und Umzug in die Aerosolve Kanister. Schließen Sie die Kanister und Zentrifuge bei 900 × g für 20 Minuten - keine Bremse. Es ist wichtig, dass keine Bremse am Ende dieser Runde wird angewendet, wenn die Bremskraft der Schicht der Zellen stören. </li><li> Nach dem Spin, sollte die PBMCs bilden einen deutlichen weißen Schicht zwischen dem gelben Plasma (oben) und transparent Ficoll (unten). Vorsichtig abschöpfen weißen Blutkörperchen Schicht mit einer Transferpipette und Transfer zum neuen Rohr. Einige Plasma und Ficoll dürfen nicht in der PBMCs gezogen werden, aber vermeiden Sie die Erstellung eines der roten Zellschicht. Typischerweise werden zwei Blutröhrchen kann in einer Zelle Rohr bei diesem Schritt kombiniert werden, um das Pellet zu vergrößern. </li><li> Add PBS, womit das Gesamtvolumen auf 50 ml und Zentrifuge bei 500 × g für 15 Minuten - geringer Bremse in aerosolve Kanister. </li><li> Flüssigkeitsaufnahme mit einer Pasteurpipette, kümmert sich nicht um das Pellet stören </li><li> Behandeln Sie mit hämolytisch-Puffer durch Zugabe von 5-6 mL in jedes Röhrchen und sanft mischen, um Klumpen zu entfernen. Inkubieren nicht mehr als 5 Minuten. </li><li> Add PBS, womit das Gesamtvolumen auf 50 ml und Zentrifuge bei 230 × g für 10 Minuten - geringer Bremse. Aerosolve Kanister sind nicht mehr für diese langsamer dreht benötigt. </li><li> Wash zwei Mal: ​​Flüssigkeitsaufnahme mit einer Pasteurpipette, Füllrohr mit PBS und Zentrifuge bei 230 × g für 10 Minuten. </li><li> Vor der abschließenden Waschschritt entfernt ein Aliquot wieder suspendierten Zellen, verdünnt mit Trypanblau, und zählen mit einer Zählkammer. Diese Zellzahl bestimmen die Reagenzienvolumina in der T-Zell-Trennstufe verwendet. </li></ol> 2. CD4 + T-Zell-Trennung * <ol><li> Flüssigkeitsaufnahme und fügen Laufpuffer auf das Gesamtvolumen bringen bis zu 40 uL pro 10 Millionen Zellen. Normalerweise braucht man 30 ul Puffer plus das restliche Pellet Volumen. </li><li> Übertragen Sie diese Lautstärke auf ein konisches 15 ml Tube. </li><li> Add-Antikörper Cocktail von der CD4 Isolation Kit - 10 uL pro 10 Millionen Zellen, Kapillarrohr, und auf Eis für 10 Minuten </li><li> Entfernen Rohr aus Eis, Kappe entfernen, und fügen Sie 30 ul Laufpuffer pro 10 Millionen Zellen </li><li> Add magnetischen Beads aus der CD4 Isolation Kit - 20 uL pro 10 Millionen Zellen, Kapillarrohr, und auf Eis für 15 Minuten </li><li> Add zehn Bände Laufpuffer zu waschen und bei 230 × g zentrifugieren für 10 Minuten. </li><li> Während der Drehung, richten Sie den Magneten und 5 ml Polypropylen-Röhrchen, in Ihrem Arbeitsbereich </li><li> Absaugen von Flüssigkeit aus Zellpellet 2 ml Laufpuffer und entfernen Klumpen mit einem Transferpipette </li><li> Mit der gleichen Übertragung Pipette Zellen in die 5-ml-Röhrchen und inkubieren in der Magnet für 15 Minuten </li><li> Vorsichtig dekantieren CD4 + Zellfraktion in einen markierten 15 mL Röhrchen durch Umdrehen des Magneten und Entleeren alle, aber die letzten Tropfen </li><li> Fügen Sie ein weiteres 2 ml Laufpuffer bis zur 5 ml Tube und entfernen Sie aus Magneten </li><li> Vorsichtig spülen Sie die CD4-Zellen aus den Seiten der Röhre und den Transfer zu einem deutlichen 15 ml Röhrchen </li><li> Add 2 mL T-Zell-Medium in jedes Röhrchen, entfernen Aliquots zur Zellzählung und Zentrifuge bei 230 × g für 10 Minuten. </li><li> Verdünnen Zellaliquote mit Trypanblau und zählen mit einer Zählkammer. Diese Zellzahl bestimmen die Anzahl der Bohrlöcher für die Expansion Kultur Schritt verwendet. </li></ol> 2.11 - * Alternativ kann MACS Säulen und Kugeln (Miltenyi Biotec), die AutoMACS Zellseparator (Miltenyi Biotec), oder Robosep Zellseparator (Stem Cell Technologies) gemäß produziert Anweisungen anstelle der Schritte 2.2 verwendet werden. 3. In-vitro-Expansion Kultur <ol><li> Absaugen von Flüssigkeit aus der CD4 + und CD4-Zell-Pellets und auf der Zellzahlen auf, fügen Kulturmedien (in der Regel 3 Millionen CD4 +-Zellen pro mL und 10 Millionen CD4-Zellen pro mL funktioniert gut für die Einrichtung der Kultur). Der Ausbau Kultur erfordert 3 bis 5.000.000 CD4-Zellen pro Vertiefung und 2 bis 3.000.000 CD4 +-Zellen pro Well in einem Gesamtvolumen von 1 mL Kulturmedium in einer 48-well-Kulturplatte. Typischerweise sind CD4 + Zellen die Begrenzung Bevölkerung </li><li> Wenn gewünscht, bestrahlen die CD4-Zellen (5000 Rad<html> s). Aliquot CD4-Zellen in die entsprechende Anzahl von Brunnen auf einem 48-Well-Platte, indem 300-500 ul jeder. Die Platte wird in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde. Die adhärenten CD4-Zellen als Antigen-präsentierende Zellen in den Ausbau Kultur dienen. </li><li> Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator. </li><li> Vertiefungen durch Zugabe von 500 uL der frischen Medien und sanft und Abpipettieren 12-20 mal mit einem Transfer-Pipette und Entfernen aller der Flüssigkeit. Dieser Waschvorgang wird hinter einer Schicht aus anhaftenden Antigen-präsentierenden Zellen zu verlassen. </li><li> Wenn die Wäsche fertig ist, fügen gerade genug Medien zum Boden jeder Vertiefung (etwa 100 uL) nass - sonst die anhaftenden Zellen austrocknen </li><li> Add 2 bis 3.000.000 CD4 +-Zellen in jedes Well. Wenn nötig, fügen Sie zusätzliche Medien auf das Gesamtvolumen in jede Vertiefung bis zu 1 mL zu bringen. </li><li> Fügen Sie die gewünschten Peptids in jede Vertiefung. Die typische Konzentration für die Stimulation von 10 ug / mL endgültig. </li><li> Legen Sie Platte in einem 37 ° C Inkubator für 7 Tage. </li><li> Nach 7 Tagen werden 50 ul Hemogen IL-2 (oder gleichwertig, wie rekombinante IL-2, 10 IU / mL) in jede Vertiefung. </li><li> Auf jeden weiteren Tag, Monitor Zellwachstum unter dem Mikroskop. Feed Brunnen, die noch nicht konfluent, indem die Hälfte der Medien, Zugabe von frischem Medium und 50 uL von IL-2. Split konfluenten Vertiefungen durch Resuspendieren der Zellen, bewegte die Hälfte der Zellen zu einem leeren Brunnen, Zugabe von frischem Medium und 50 uL von IL-2. Zurück Zellen-Inkubator. </li><li> Die expandierende Zellen werden bereit sein für das Tetramer nach 13-15 Tagen der Kultur. </li></ol> 4. Visualizing T-Zellen durch Tetramer-Färbung <ol><li> Kauf oder montieren Tetramere an das Peptid / MHC-Kombinationen, die stimulierten CD4 + T-Zellen (siehe Diskussion zum Quellen der Tetramer-Reagenzien) übereinstimmen übereinstimmen. Tetramere sollte ~ 0,5 mg / ml Lösung sein. </li><li> Entfernen Platte aus Inkubator </li><li> Vorsichtig abziehen Hälfte der Medien aus jedem Well </li><li> Eine kleine Menge von Zellen aus jedem Well - typischerweise 75 &amp;mgr; l oder ca. 50.000 Zellen - in eine 5 ml Polystyrol FACS-Röhrchen </li><li> Add Tetramer - in der Regel 1 ul pro 50 ul Gesamtvolumen - und in 37 ° C Inkubator für 1-2 Stunden. Es ist auch ratsam, eine zweite Teilmenge von Zellen aus jedem Well Fleck mit einer unpassenden Tetramer als negative Kontrolle. </li><li> Label-Zellen mit anti-CD3, anti-CD4 und anti-CD25 Antikörper, die durch Zugabe von 3-10 ul jedes Antikörpers. Zusätzliche oder alternative Antikörper Marker verwendet werden kann. Jedoch nicht verwenden PE-markierten Antikörpern, da dieser Kanal für die Tetramere reserviert werden muss. Zu dieser Zeit, auch Label einfarbig oder Isotypkontrollen mit zusätzlichen Zellen. </li><li> Inkubieren Antikörper markierten Zellen für 15-30 Minuten auf Eis oder bei 4 ° C. </li><li> Wash jedes Röhrchen mit 0,5 bis 2 ml Laufpuffer und Zentrifuge bei 230 × g für 10 Minuten. </li><li> Dekantieren Sie vorsichtig Flüssigkeit aus FACS-Röhrchen. Speichern Sie alle Rohre in einem abgedeckten Behälter (vorzugsweise auf Eis) für die anschließende FACS-Analyse. </li></ol> 5. Durchflusszytometer Datenerfassung und-analyse <ol><li> Kalibrieren Sie das Durchflusszytometer mit Verweis Perlen. </li><li> Stellen Sie sicher, Geräteeinstellungen: <ol><li> Mit ungefärbten Kontrolle Zellen oder Isotypkontrollen, passen Sie den Pfad der lebensfähigen Lymphozyten-Gate (FSC vs SSC). Entfernen Autofluoreszenz von allen Kanälen durch Zentrieren der Bevölkerung (durch Änderung der Gain-Einstellungen) unter den ersten zehn Jahren auf jeder Achse. </li><li> Mit einfarbige Röhren, in der Mitte Ereignisse im richtigen Quadranten für jede einzelne Farbe (durch Änderung der Vergütung Einstellungen). </li><li> Führen Sie eine Feinabstimmung der Geräteeinstellungen über einen Schlauch mit einem irrelevanten Tetramer gefärbt. Insbesondere die Einstellungen für die PE-Kanal muss möglicherweise angepasst werden, weil Tetramere oft Flecken heller als der Antikörper zu kontrollieren. Die irrelevant Tetramer sollte Fleck &lt;0,5% der CD4 +-Zellen. </li></ol></li><li> Erfassung von Daten für jede Röhre <ol><li> Sammeln Sie Veranstaltungen für jeden Probenröhrchen und negative Kontrolle Rohr </li><li> Erfassen und Speichern mindestens 20.000 Veranstaltungen für Analysys </li></ol></li><li> Analysieren von Daten <ol><li> Import von Daten-Dateien in FACS-Analyse-Software (zB CellQuest Software, WinMDI oder FlowJo). Starten Sie Ihre Analyse mit einem Rohr gebeizt mit einem irrelevanten Tetramer. </li><li> Plot FSC vs SSC und zeichnen Sie einen Schutzzaun um den Live-Lymphozyten (Abbildung 1, oben links). </li><li> Plot CD4 vs CD3 (gated zu leben Lymphozyten nur Show) und ziehen Toren rund um die CD3 + und CD4 +-Populationen (Abbildung 1 oben rechts). </li><li> Plot CD4 vs Tetramer (gated auf CD3 + Lymphozyten nur Show) und stellen Sie die Quadrantengrenzen so, dass die CD4 + Tetramer + Bevölkerung ist weniger als 0,5% (Abbildung 1 unten links). </li><li> Plot CD25 vs Tetramer (gated an CD4 +-Lymphozyten nur Show) und stellen Sie die Quadrantengrenzen, so dass die CD25 + + Tetramer Bevölkerung weniger als 0,5% (Abbildung 1 unten rechts) ist. </li><li> Analysieren Sie alle Probenröhrchen ohne die Tore. </li></ol></li></ol>1167/JOVE% 20FIGURE% 201.png &quot;alt =&quot; Bild 1 &quot;width =&quot; 600 &quot;height =&quot; 342 &quot;/&gt; Abbildung 1. Representative negative Kontrolle Tetramer Färbung Ergebnisse. Die linke obere Feld zeigt Vorwärtsstreuung Verse side scatter und die Lymphozyten-size-Gate (R1). Der obere rechte Fenster ist geschlossen für R1 und zeigt ant-CD4 oder anti-CD3 und CD3 + (R2) und CD4 + (R3) Toren. Die linke untere Panel ist geschlossen für R2 und zeigt anti-CD4 gegenüber Tetramer. Das untere rechte Fenster ist geschlossen für R3 und zeigt anti-CD25 gegenüber Tetramer. Die Quadranten sowohl für Tetramer Parzellen wurden auf 0,5% festgelegt. 6. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Das Tetramer-positiven Zellen sollte eine deutliche Bevölkerung unter den erweiterten CD4 +-Zellen (Abbildung 2). </li><li> Tetramer-positiven Zellen sind in der Regel CD25 + CD4 und oft hoch. </li><li> In einigen Fällen kann ein MHC / Peptid-Kombination geben Hintergrundfärbung (oft durch ein Peptid mit schlechten Löslichkeit verursacht). Solche Hintergrundfärbung kann von einem echten positive differenziert werden, da die &quot;false positive&quot; Zellen nicht eine einzige deutliche Bevölkerung entweder auf der CD4 vs Tetramer oder CD25 vs Tetramer Plots (Abbildung 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362" /> Abbildung 2. Representative positive Tetramer Färbung Ergebnisse. Die Panel-Layout und Gating-Strategie sind identisch mit 1 Abbildung. Das Tetramer-positiven Zellen erscheinen als eigenständige CD4 hohe Bevölkerungsdichte auf dem anti-CD4 gegenüber Tetramer-Panel und eine deutliche CD25 + Population auf dem anti-CD25 gegenüber Tetramer-Panel. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="Abbildung 3" width="600" height="336" /> Abbildung 3. Representative &quot;false positive&quot; Tetramer Färbung Ergebnisse. Die Panel-Layout und Gating-Strategie sind identisch mit 1 Abbildung. Die anti-CD4 gegenüber Tetramer-Panel zeigt eine undeutliche &quot;mounded&quot; Färbung. Die anti-CD25 gegenüber Tetramer zeigt auch eine &quot;mounded&quot;-Färbung, ohne klaren Trend in Richtung zu CD25 +.

<ol>
	<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4++T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer-guided+epitope+mapping:+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4++T+cell+epitopes+from+complex+antigens.">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li></ol>

Verständnis der Rolle der CD4 + T-Zellen im Immunsystem ist von grundlegender Bedeutung. Allerdings können Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen schwer zu erkennen und zu isolieren, die mit traditionellen Methoden. Im Gegensatz dazu erlauben MHC-Klasse-II-Tetramere die direkte Visualisierung von CD4 + T-Zellen mit der gewünschten Antigen-Spezifität. Dieses Video zeigt die Isolierung, Reinigung und In-vitro-Amplifikation von CD4 + T-Zellen und deren anschließende Visualisierung mit Tetrameren. Klasse II Tetramere sind...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Class 2 Laminar flow biosafety cabinet</td>
<td>equipment</td>
<td>Thermo Forma</td>
<td>1200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical Tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>47747-182</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>1X PBS (Ca/Mg free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30028.02</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Ficoll-paque PLUS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1440-03</td>
<td>foil wrapped to protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipet Aid XP</td>
<td>equipment</td>
<td>Drummond</td>
<td>4-000-101</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>10 mL pipet</td>
<td>equipment</td>
<td>Corning/Costar</td>
<td>CLS4492</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosolve Canisters</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>359481</td>
<td>with 50 mL inserts</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>GS-6R</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipets </td>
<td>equipment</td>
<td>Samco</td>
<td>202-20S</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>14672-200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemolytic Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6146</td>
<td>0.2% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR </td>
<td>15170-208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>05-527-90</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-155</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>EasySep&reg; Magnet</td>
<td>equipment</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>18000</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL polypropylene tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352063</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td> Invitrogen</td>
<td>22400-089</td>
<td>with 25 mM HEPES</td>
</tr>
<tr>
<td>Pooled human serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1570-063</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>500mL 0.22 micron bottle top filter</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalgene</td>
<td>595-3320</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>48-well plate</td>
<td>equipment</td>
<td>Costar</td>
<td>3548</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>37&deg;C CO2 incubator</td>
<td>equipment</td>
<td>Sanyo Scientific</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL synthetic peptide</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Custom synthesis from any peptide vendor</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL FACS tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352008</td>
<td>Polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide loaded class II tetramer (as described)</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Prepared by the BRI tetramer core</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD3</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>347344</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD4</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0049-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD25</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>11-0259-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Facs Calibur Flow Cytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>342975</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers

Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode basiert auf der hoch spezifische Wechselwirkung zwischen Peptid beladenen MHC und die entsprechenden T-Zell-Rezeptor. Während die Affinität eines einzelnen MHC / Peptid-Molekül ist gering, Vernetzung MHC / Peptid-Komplexe mit Streptavidin erhöht die Avidität der Interaktion, so dass ihre Verwendung als Färbereagenzien. Wegen der relativ niedrigen Frequenzen von CD4 + T-Zellen (~ 1 in 300.000 für einen einzigen Spezifität) diesen Test nutzt eine in vitro-Amplifikation Schritt zu seiner Schwelle Erkennung zu erhöhen. Mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut durch Ficoll Unterlage gereinigt. CD4 + Zellen werden dann durch negative Selektion mittels biotinylierten Antikörper-Cocktail und anti-Biotin markiert magnetische Kügelchen getrennt. Mit adhärenten Zellen aus der CD4-Zell-Fraktion als Antigen-präsentierende Zellen, CD4 + T-Zellen werden in Medien, indem eine antigene Peptid-und IL-2 erweitert. Die expandierten Zellen sind mit der entsprechenden Klasse II Tetramer durch Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde und anschließend gefärbt mit Oberfläche Antikörper wie anti-CD4, anti-CD3 und anti-CD25 gefärbt. Nach der Etikettierung können die Zellen direkt mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Das Tetramer-positiven Zellen bilden typischerweise eine deutliche Bevölkerung unter den erweiterten CD4 +-Zellen. Tetramer-positiven Zellen sind in der Regel CD25 + CD4 und oft hoch. Da der Pegel der Hintergrundgeräusche Tetramer-Färbung kann variieren, sollten positive Färbung Ergebnisse immer auf die Färbung von den gleichen Zellen mit einem irrelevanten Tetramer verglichen werden. Mehrere Variationen dieses grundlegende Assay sind möglich. Tetramer-positive Zellen können für weitere phänotypische Analyse, Aufnahme in ELISPOT oder Proliferation Assays oder andere sekundäre Assays sortiert werden. Mehrere Gruppen haben auch Co-Färbung mit Tetrameren und entweder Anti-Zytokin-oder Anti-FoxP3 Antikörper nachgewiesen.

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Dieses Verfahren zeigt die Reinigung und in vitro Expansion von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus ganzen peripheren Blut und deren Visualisierung mit Hilfe der MHC-Klasse II Tetramere. Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von T-Zellen mit einem einzigen Antigen-Spezifität und definierte MHC-Klasse II Einschränkung.

Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

JoVE Journal

Biology

21.6K Aufrufe.  Benaroya Research Institute. Dieses Verfahren zeigt die Reinigung und in vitro Expansion von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus ganzen peripheren Blut und deren Visualisierung mit Hilfe der MHC-Klasse II Tetramere. Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von T-Zellen mit einem einzigen Antigen-Spezifität und definierte MHC-Klasse II Einschränkung.

Serie: Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Forschung

Biologie

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Eine Technik, um gleichzeitig zu visualisieren Virus-spezifische CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zellen In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

Isolierung von CD4+ T-Zellen und Analyse von zirkulierenden T-follikulären Helfer (cTfh) Zelle Teilmengen von peripheren Blut mittels 6-Farb Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...