Unser Protokoll beschreibt die genetische Veränderung von CAR-T-Zellen während ihrer Herstellung über die CRISPR-Technologie, um effektivere und weniger toxische Produkte zu erzeugen. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass CAR-T Zellproduktion und genetische Manipulation in einer Zelle mit guter Effizienz auftreten können. Die MdB-Doktorandin, Michelle Cox, Technologin und Doktorandin, und Reona Sakemura, postdoktorandische Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren.
Nach der Isolierung von T-Zellen aus geernteten peripheren mononukleären Blutzellen beginnen Sie, sie zu kultivieren, indem Sie zuerst T-Zell-Medium vorbereiten und es dann sterilisieren, indem Sie es durch einen 0,45 Mikrometer sterilen Vakuumfilter und dann mit einem 0,22 Mikrometer sterilen Vakuumfilter filtern. Am Tag der T-Zell-Stimulation oder Tag Null, vor der Stimulation, waschen CD3/CD28 Perlen, indem Sie das erforderliche Volumen der Perlen in einem sterilen 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und Resuspending in einem Milliliter TCM. Setzen Sie das Rohr eine Minute lang mit einem Magneten in Kontakt.
Dann die TCM ansaugen und in einem Milliliter frischer TCM wieder aufsetzen, um die Perlen wieder zu waschen und insgesamt drei Wäschen zu wiederholen. Und schließlich, resuspend die Perlen in einem Milliliter TCM. Nach dem Zählen der T-Zellen, übertragen Sie die Perlen zu den T-Zellen im Verhältnis von drei zu eins Perlen zu Zellen.
Dann verdünnen Sie die Zellen auf eine endige Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter und inkubieren bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 für 24 Stunden. Nach dem Erwerb eines CART19-Konstrukts in einem lentiviralen Vektor führen Sie die lentivirale Produktion durch, indem Sie zunächst lentivirales Plasmid, Verpackungsvektor, Hüllkurvenvektor, vorkomplexereagenz, Transfektionsreagenz und Transfektionsmedium bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubieren. Durchführung von lentiviralen Arbeiten mit BSL2+-Vorkehrungen, einschließlich Zellkulturhauben, persönlicher Schutzausrüstung und Desinfektion von gebrauchten Materialien mit Bleichmittel vor der Entsorgung.
Nach der Inkubation fügen Sie diese Transfektionsreagenzien zu den 293 T-Zellen hinzu, die 70 bis 90 % Konfluenz erreicht haben, und die transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 kulturieren. Nach 24 und 48 Stunden nach der Transfektion, Ernte, Zentrifuge, Filter und Konzentrat virushaltiger Überstand durch Ultrazentrifugation und Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Am ersten Tag, sanft resuspendT-Zellen, die mit einer Million Zellen pro Milliliter am Tag Null stimuliert wurden, um die Rosetten der Zellen aufzubrechen.
Fügen Sie den simulierten T-Zellen unter geeigneten BSL2+-Vorkehrungen frische oder gefrorene geerntete Viren bei einer Vielzahl von Infektionen von 3,0 hinzu. Die transduzierten T-Zellen bei 37 Grad Celsius, 5% CO2, weiterhin inkubieren. An den Tagen drei und fünf zählen SIE CAR-T-Zellen und fügen Sie der Kultur frische vorgewärmte TCM hinzu, um eine CAR-T-Zellkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter aufrechtzuerhalten.
Sechs Tage nach der Simulation entfernen Sie Perlen aus den transduzierten T-Zellen, indem Sie zuerst die Zellen ernten und wieder aussetzen. Übertragen Sie die Zellen in 50 Milliliter konische Röhren und legen Sie die Rohre in einem Magneten für eine Minute. Nach dem Sammeln des CAR-T-zellhaltigen Überstandes und dem Wegwerfen der Perlen, legen Sie die Zellen mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter in einen Kulturkolben zurück in die Kultur.
Verwenden Sie eine Stichprobe von Zellen für die Durchflusszytometrie, um die Oberflächenexpression der CARs zu bewerten. Den Rest inkubieren, um die Expansion wieder aufzunehmen und dann die Zellen an Tag acht zu ernten und zu kryo-konservieren, wie im Manuskript beschrieben. Um den granulozyten Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor zu stören, verwenden Sie eine Guide-RNA, wie im Manuskript beschrieben.
Transfektionsreagenzien bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation, fügen Sie sie zu den 293 T-Zellen, die 70 bis 90% Konfluenz erreicht haben und Kultur der transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius, 5% CO2, um ein Lentivirus zu produzieren. Nach 24 und 48 Stunden virushaltigen Überstand durch Ultrazentrifugation in 50 Milliliter Ultrazentrifugenröhren ernten und konzentrieren und bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung einfrieren.
Dann am ersten Tag, sanft die T-Zellen wieder aussetzen, um Rosetten aufzubrechen. In einem BSL2+zugelassenen Labor, um CAR-T-Zellen zu erzeugen, fügen Sie CAR19 lentivirus und GMCSF-targeting CRISPR lentivirus zu den simulierten T-Zellen hinzu. Am dritten Tag und Tag fünf für erfolgreich transduzierte lentiCRISPR-bearbeitete T-Zellen mit Puromycinresistenz, behandeln Zellen mit Puromycindihydrochlorid in einer Konzentration von einem Mikrogramm Puromycin pro Milliliter.
Die Gezeitensequenzierung wurde verwendet, um eine GM-CSF-Reduktion in GM-CSF-Knockout CART19-Zellen mit einer Störeffizienz von ca. 71% Flow-Plots von CAR-T-Zelloberflächenfärbungen zu bestätigen, die auf lebenden CD3-positiven Zellen eingezäutt sind, zeigen, dass sowohl wild-type CART19 als auch GM-CSF knockout CART19 erfolgreich und in ähnlicher Weise den CAR-Oberflächenrezeptor in vitro ausdrücken. Auf der anderen Seite zeigt die intrazelluläre Färbung von GM-CSF durch Durchflusszytometrie, die auch auf lebenden CD3-positiven Zellen eingezäutt ist, eine verminderte Expression von GM-CSF in den Knockout-Zellen im Vergleich zu wildtypisierten CART19-Zellen, die den funktionellen Erfolg des Knockouts bestätigen. Besondere Vorsicht ist bei den Transduktionsschritten dieses Verfahrens geboten, da sie für die Entwicklung genetisch veränderter CAR-T-Zellen am wichtigsten sind.
Die beschriebene Methode kann möglicherweise auf eine Vielzahl von Genen angewendet werden, um CAR-T-Zellen über CRISPR/CAS9 zu modifizieren, um ein weniger toxisches und effektiveres Produkt zu erzeugen. Die CRISPR/CAS9-Technologie bietet Strategien, um direkt auf das Genom von CAR-T-Zellen zu zielen, um Lösungen für aktuelle klinische Mängel zu entwickeln.
