Die Thymustransplantation ist eine wichtige Methode zur Untersuchung der Thymus-Epithelzellfunktion und der T-Zell-Reifung in vivo. Dieses einfache und effiziente Protokoll kann verwendet werden, um Maus 18,5 Thymus für die nachfolgende Transplantation in eine Nierenkapsel zu isolieren und zu kultitonieren. Das Protokoll für die 18,5-Thymus-Transplantation kann für thymische Transplantationen in anderen Entwicklungsstadien oder für andere Gewebe ähnlicher Größe modifiziert werden.
Auch dieses Verfahren ist sehr einfach. Die Details für einige der Fallstempel sollten sorgfältig überprüft werden, wenn diese Technik zum ersten Mal durchzuführen. Dieses Verfahren enthält detaillierte Manipulationen, die mit der Visualisierung besser veranschaulicht werden können.
Nach dem Opfer wischen Sie den embryonalen Tag 18.5 schwangere Maus mit 70%Ethanol und verwenden Autoklaven sterilisierte Instrumente, um einen v-förmigen Schnitt auf den Bauch von der Blase bis zu jedem Horn der Gebärmutter zu machen. Verwenden Sie eine Schere, um das Mesometrium und die zervikalen und vaginalen Bereiche zu schneiden und ernten Sie die Gebärmutter in eine Petrischale mit kalten PBS auf Eis. Schneiden Sie die vordere Gebärmutterwand von einem Gebärmutterhorn zum anderen, um die Embryonen innerhalb der Umhüllung dezidua zu entlarven und verwenden Sie eine feine Pinzette, um die dezidualen Gewebe zurückzuschälen.
Schneiden Sie die Nabelschnur, um die Embryonen für die Übertragung in eine neue Petrischale auf Eis freizugeben. Um den ersten Thymus zu ernten, wischen Sie einen Embryo mit 70% Alkohol ab und übertragen Sie den Embryo in eine neue Petrischale. Nach der Enthauptung, fixieren Sie den Embryo in der Schale in der Supine-Position und verwenden Sie sterile Schere, um die seitliche Brustwand horizontal entlang der Achselfront zu schneiden.
Schneiden Sie das Zwerchfell, um die Brust zu öffnen. Der Thymus sollte als zwei weiße Lappen sichtbar sein, die sich vor der Luftröhre und neben dem Herzen befinden. Sorgfältig gebogene Spitzenzange hinter dem Thymus einsetzen und vorsichtig nach oben ziehen, um das Gewebe zu ernten.
Überprüfen Sie die Integrität des Thymus, um zu bestätigen, dass er zwei Gelenklappen enthält. Dann waschen Sie den Thymus mit PBS, bevor Sie ein Stereomikroskop verwenden, um das Bindegewebe und die Blutgefäße zu schneiden. Wenn alle Thymi gesammelt wurden, übertragen Sie jedes saubere Gewebe in einzelne Brunnen einer 24 Brunnenplatte, die 500 Mikroliter Kulturmedium pro Brunnen enthält.
Und fügen Sie 2'deoxygranosin zu einer endletzten Konzentration von 1,25 Millimolar pro Brunnen hinzu. Dann legen Sie den isolierten Thymi acht Tage lang in den Zellkultur-Inkubator. Verwenden Sie am letzten Kulturtag eine Schere, um eine Kopfhautvenennadel auf dem Infusionsrohrteil in einem 45-Grad-Winkel zu schneiden und bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen bei einem nackten Empfängertier.
Legen Sie die Maus auf den Operationstisch in einer rechten seitlichen Position und verwenden Sie einen 0,5%Povidon Jod tupfer, um die Haut im chirurgischen Bereich zweimal von innen nach außen des Körpers zu tumschen. Verwenden Sie das Skalpell, um einen fünf bis neun Millimeter großen Hautschnitt parallel zur Wirbelsäule im linken Nierenbereich zu machen und das Unterhautgewebe und den Muskel zu durchschneiden, um die Bauchhöhle zu öffnen. Heben Sie mit einer Hand eine Pinzette mit einer Hand den Muskel und das Fettgewebe von der Wirbelsäulenseite in die Spinne ein und verwenden Sie die andere Hand, um die Niere vorsichtig herauszupressen.
Um die Nierenkapsel während der Operation feucht zu halten, befeuchten Sie die Oberfläche der Niere mit Einer Saline und kratzen Sie die Nierenkapsel auf der unteren rechten Seite sanft um 1/2 bis 2/3 die Breite der Niere. Schieben Sie die Infusionsröhre in den Nick der Kapsel und lösen Sie die Nierenkapsel vorsichtig von der Niere lang die lange Seite der Niere etwa drei bis vier Millimeter in die Nierenkapsel. Ziehen Sie dann das Infusionsrohr zurück.
Um den Thymus in den erzeugten subkapsulären Raum zu implantieren, waschen Sie einen Kulturthymus zweimal in frischer Kochung und verbinden Sie das abgeschnittene Infusionsrohr mit einer Spritze. Den vorbereiteten Thymus langsam in das modifizierte Infusionsrohr absaugen. Und legen Sie die Infusionsröhre vorsichtig in die Nierenkapsel ein, bis sie den oberen Pol erreicht.
Um den Thymus in die Nierenkapsel zu geben, ziehen Sie die Röhre langsam zurück und drücken Sie gleichzeitig sanft den Kolben. Mit einer Alkohollampe, leicht erhitzen die Kopfhautnadel und nach der Bestätigung, dass der gesamte Thymus im subkapitularen Raum ist, verwenden Sie die beheizte Nadel, um den Nick zu kauterisieren. Stellen Sie die kauterisierte Niere in die Bauchhöhle wieder her und schließen Sie das Peritoneum und den Muskel mit Nähten.
Mit einer modifizierten unterbrochenen vertikalen Matratzennaht, schließen Sie den Hautschnitt mit mindestens drei Knoten und verwenden Sie einen Povidon Jod tupfer, um den Schnitt zu desinfizieren. Dann bieten eine subkutane Injektion von Antibiotika und Analgesie und legen Sie die Maus unter einer Infrarotlampe mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung. Hier kann ein isolierter embryonaler Tag 18,5 Thymus beobachtet werden, der zwei komplette Lappen enthält.
Unmittelbar nach der Implantation kann der Thymus unter der Nierenkapsel an der Spitze der Empfängerniere visualisiert werden. Nach acht Wochen Wachstum innerhalb des Nacktmaus-Empfängertiers bleibt der Thymus unter der Kapsel, nimmt aber robust zu. T-Zellen werden sowohl im transplantierten Thymus als auch im peripheren Blut von Nacktmausempfängern produziert.
Aber wie erwartet werden keine T-Zellen in der Peripherie von nicht transplantierten Nackttieren nachgewiesen. Darüber hinaus wurde in diesem repräsentativen Experiment kein LacZ-Gen in den peripheren T-Zellen nachgewiesen, die aus dem peripheren Blut von Nacktmausempfängern entnommen wurden, die mit Thymuslappen transplantiert wurden, die das LacZ-Allel enthielten, was darauf hindeutet, dass periphere T-Zellen von den Empfängertieren erzeugt wurden. Seien Sie sanft, wenn Sie die Röhre in eine Nierenkapsel schieben.
Vermeiden Sie das Brechen der Kapsel. Und stellen Sie sicher, dass Sie genügend Platz in der für die Thymus-Lieferung haben. Thymische oder periphere T-Zellpopulationen können mit Demkzytometern analysiert werden.
Wo, Immunantworten in peripheren Geweben des Empfängers können durch I2d und die Immunhistochemische Analyse analysiert werden.
