This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).

1. Befestigung des Kopfes auf Krägen und Einbettung in Paraffin Hinweis: Alle Schritte in dem Fixierungsprozess sollte in einem Abzug durchgeführt werden. Methylbenzoat, während kein gesundheitliches Risiko darstellen, hat einen sehr deutlichen Geruch, die überwältigend sein kann, wenn nicht in einem Abzug behandelt. <ol><li> Bevor die Fliegen anesthetizing, bilden 50 ml Carnoy-Lösung durch Zugabe von 15 ml Chloroform und 5 ml Eisessig auf 30 ml 99% Ethanol (nicht das Chloroform mischen und Essigsäure). Gießen Sie es in einem Glasbehälter mit einem flachen Boden, wie ein Kristallierschale, um sicherzustellen, dass die Kragen flach legen kann und vollständig von der Lösung bedeckt. </li><li> Anesthetize die Fliegen mit CO 2 oder Äther. </li><li> Thread Fliegen (bis zu 20 bei den meisten Krägen) durch den Hals in die Krägen mit einer Pinzette. Denken Sie daran , alle Köpfe in der gleichen Orientierung auszurichten, wie in 1A zu sehen ist , und sanft sein , um sicherzustellen , dass keine Beschädigung des Kopfes oder der Augen auftritt. </li><li> Umfassen sine oculis Fliegen (Pfeile, 1A) an zufälligen Positionen so dass die Reihenfolge der Fliegen können leicht in den Abschnitten identifiziert werden. Darüber hinaus, wenn die experimentellen Fliegen einen hellen oder weißen Augenfarbe haben, Gewinde einige rote Augen Fliegen, wie Wildtyp, zwischen ihnen, dass genügend Pigment, um sicherzustellen, vorhanden ist, um die Folie zu färben. Notieren Sie sich die Reihenfolge der Fliegen auf einem Protokollblatt zusammen mit dem Bund Nummer, wenn mehr als ein Kragen verwendet wird. </li><li> Sobald ein Kragen abgeschlossen ist, legen Sie sie in die vorbereitete Carnoy-Lösung für 3,5 - 4 Std. </li><li> Dump die Carnoy-Lösung in den entsprechenden Entsorgungsbehälter und die Ethanol wäscht beginnen. Stellen Sie sicher, langsam zu gießen, um nicht die Platzierung der Krägen in dem Behälter zu stören. </li><li> Waschen Sie die Kragen für 30 min in 99% Ethanol zweimal. </li><li> Waschen Sie die Krägen in 100% Ethanol für 1 h. Achten Sie darauf, die Waschungen auf Zeit zu ändern overdehydration zu verhindern. </li><li> Setzen Sie die Kragen in methylbenzoateO / N bei RT. Abdichten des Behälters mit Parafilm die Verdampfung des methylbenzoat zu verhindern. </li><li> Gießen Sie die methylbenozate in die richtige Einwegbehälter in der Abzugshaube. Fügen Sie eine zuvor hergestellte Mischung von 1: 1 mit niedrigem Schmelzpunkt (56 - 57 ° C) Paraffinwachs und methylbenzoate. Von diesem Zeitpunkt an müssen die Kragen in einem Inkubator bei 65 ° C gehalten werden, um sicherzustellen, dass das Paraffin nicht aushärtet. </li><li> Gießen Sie die methylbenozate und Paraffingemisch in die richtige Einwegbehälter, und gießen geschmolzene reine Paraffinwachs, gehalten bei 65 ° C, auf den Kragen. </li><li> Ändern Sie das Paraffin nach 30 Minuten und wiederholen Sie diesen mindestens 5-mal. Mindestens 6 - 8 Waschungen durchgeführt werden sollte. </li><li> Sobald die Waschungen abgeschlossen sind, legen Sie die Kragen in einen Gummieiswürfelschale mit Schlitzen in etwa die Größe der Kragen. Gießen geschmolzene Paraffin über sie, bis sie vollständig bedeckt und lassen Sie es O zu härten / N (versuchen Sie Luftblasen zu vermeiden). </li><li> Entfernen Sie die Paraffinblöcke containing die Kragen aus dem Eiswürfelschale. Trennen Sie den Paraffinblock vom Kragen mit einer Rasierklinge, sanft den Kragen abbrach. Die Köpfe werden im Paraffinblock, während die Körper im Kragen bleiben. Die Blöcke können bei Raumtemperatur gehalten werden. </li><li> Um die Kragen reinigen, genießen sie in einem deparafinization Mittel bei 65 ° C, um das Paraffin, sauber und mit Licht Wäsche zu entfernen und waschen in Ethanol vor der Wiederverwendung. </li></ol> 2. Sectioning und Montage <ol><li> Aufzuwärmen eine Heizplatte auf 50 ° C. Legen Sie die Objektträger (oder Metallmontageblöcke) und Rasierklingen auf der Platte und lassen Sie sie erwärmen. </li><li> Je nach der gewünschten Ausrichtung zum Schneiden, befestigen den Block Paraffin entweder mit den Köpfen in Richtung der Seite (für horizontale Segmente) oder nach oben (zum frontalen Abschnitte) zu einem beheizten Befestigungsblock (kurz den Block an der Kontaktseite Schmelzen). Entfernen Sie den Block von der Heizplatte und lassen Sie es mindestens 10 mi abkühlenn, um sicherzustellen, dass das Paraffin für eine einwandfreie Abdichtung auf den Befestigungsblock genügend ausgehärtet ist. Halten Sie die Reihe der Köpfe parallel ausgerichtet mit der Oberfläche des Blocks so viel wie möglich Unebenheiten zu verhindern. </li><li> Nehmen Sie eine Rasierklinge und schneiden Sie das überschüssige Paraffin weg von den Fliegenköpfen, so dass nur eine kleine Reihe mit den eingebetteten Köpfen bleibt (der Rasierklinge bis zum leichteren Trimmen erwärmt werden). Achten Sie darauf, nicht zu viel zu trimmen, so dass das Paraffin nicht während des Schneidens (mehr Trimmen kann während des Schneidens erfolgen) nicht bricht. </li><li> Platzieren des Montageblocks in den Objekthalter des Mikrotoms und sicherzustellen, dass die Ausrichtung der Reihe von Köpfe möglichst parallel zu dem Rand der Klinge. </li><li> Bereiten Sie Mikroskop-Objektträger, indem sie mit einer dünnen Schicht aus Poly-L-Lysin (PLL) Lösung abdeckt und lassen Sie sie für 5 Minuten trocknen lassen. Decken Sie sie mit Wasser kurz vor dem Gebrauch. </li><li> Schneiden 7 um Abschnitte und übertragen das Band der Abschnitte mit dem Schlitten auf dem Wasser schwimmen. &lt;br /&gt; Hinweis: Um das gesamte Gehirn für horizontale Schnitte zu erhalten, sammeln wir das Band von beim Start in das Auge zu schneiden, bis der Kopf vollständig geschnitten wurde (von den Rüssel in das Gehirn schneiden). Mehr als eine Folie kann für den gesamten Kopf benötigt werden. </li><li> Legen Sie die Folie auf einer Heizplatte bei 37 ° C und lassen Sie das Band für ca. 1 min zu erweitern. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Wasser (Aus- oder mit einem Gewebe Gießen) und trocknen Sie die Dias O / N. </li><li> Entfernen Sie das Paraffinwachs aus dem Schlitten durch die Folien in einem hohen, vertikalen Schiebe Färbeküvette mit einem deparafinization Mittel gefüllt platzieren (vollständig die Abschnitte abdeckt). Führen Sie 3 Waschungen von 30 min - 60 min je. </li><li> Entfernen Sie die Folie aus der letzten Wäsche. Platz 2 Tropfen Einbettungsmittel auf die Folie und decken Sie es mit einem großen Deckglas. </li></ol> 3. Fotografieren und Analyse der Bereiche <ol><li> Lassen Sie die vorbereiteten Objektträger 1 zum Trocknen - 2 d. Dann untersuchen sie auf einem Fluoreszenz Microscope unter blauem Licht. </li><li> Verwenden Sie eine niedrigere Vergrößerung der Ausrichtung der Fliegen zu bestimmen und die Region von Interesse zu finden, wenn auf eine bestimmte Region konzentrieren. HINWEIS: Für die sws Fliegen (siehe Abbildung 2), finden wir den Abschnitt, der die große Kommissur enthält und ein Bild nehmen ( in der Regel bei 40 - facher Vergrößerung). Wenn das gesamte Gehirn Analyse (wie in Abbildung 3), blättern wir durch alle Abschnitte aus einem Kopf und entweder fotografieren Sie den Abschnitt mit den schwersten Phänotyp oder alle Abschnitte , die Vakuolen zeigen. </li><li> Für eine Doppelblind-Analyse nehmen und die Anzahl Bilder, ohne den Genotyp zu kennen und den Kragen Nummer und Position des Kopfes in der Reihe aufnehmen um sie später zu identifizieren. </li><li> Sobald die Bilder aufgenommen wurden, analysieren sie eine Imaging-Software verwenden. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Vakuolen pro Abschnitt oder pro Kopf. Um die Vakuole Größe messen, öffnen Sie die Bilder in einem Software-Programm und wählen Sie die Vakuolen mit einer Auswahl zul. Bestimmen die Anzahl der Pixel in der ausgewählten Vakuolen. </li><li> Für die Umstellung auf &amp; mgr; m 2, nehmen Sie ein Foto von einem Stufenmikrometer Kalibrierungsdia an der Vergrößerung für den Erwerb von Fotos verwendet. Bestimmung der Menge von Pixeln in 100 &amp; mgr; m 2 einen Umrechnungsfaktor zu berechnen. </li><li> Wandeln die Gesamtpixelzahl in &amp; mgr; m 2 durch die Anzahl der Pixel mit dem Umrechnungsfaktor in dem obigen Schritt berechnet dividiert wird . </li></ol>

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+mediates+tau-induced+neurodegeneration+in+Drosophila.">Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila.</a> J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).</li><li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+expression+of+polyglutamine+proteins+induce+behavioral+changes+and+aggregate+formation+in+Drosophila.">Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila.</a> Glia. 49, 59-72 (2005).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+TDP-43+proteinopathy.">A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das beschriebene Verfahren stellt ein Mittel Neurodegeneration im Gehirn von Drosophila zu quantifizieren. Während andere Methoden, wie einen spezifischen Zelltyp zu zählen, kann die Neurodegeneration zu identifizieren, verwendet werden, ist der Vorteil dieses Verfahrens, dass es im Allgemeinen angewendet werden kann. Zählen erfordert, dass Zellen können diese Zellen zuverlässig identifiziert werden unter Verwendung entweder eines spezifischen Antikörpers oder die Expression eines zellspezifischen Marker,...

Mit der Zunahme der Lebenserwartung haben neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer oder Parkinson eine zunehmende Gesundheitsbedrohung für die allgemeine Bevölkerung geworden. Nach Angaben der National Institutes of Health, 115 Millionen Menschen weltweit sind voraussichtlich von Demenz im Jahr 2050 betroffen sein Obwohl erhebliche Fortschritte für viele von ihnen bei der Identifizierung von Genen und Risikofaktoren beteiligt in zumindest einige dieser Krankheiten gemacht worden, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch nicht bekannt oder nicht gut verstanden. Einfache invertebrate Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster bieten eine Vielzahl von experimentellen Vorteile , die Mechanismen von neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen, einschließlich eines kurzen Lebenszyklus, eine große Anzahl von Nachkommen, und die Verfügbarkeit von gut etablierten und manchmal einzigartigen genetischen und molekularen Methoden 1 -12. Weiterhin sind diese Organismen zugänglich unvoreingenommeneInteraktion Bildschirme, die Faktoren, die zu diesen Krankheiten, die durch ihre erschwerende oder lindernde Wirkung auf neurodegenerative Phänotypen identifizieren können. Die Analyse solcher genetischer Interaktionen und Beurteilung Alterungseffekte erfordert quantitative Protokolle Neurodegeneration zu erkennen und deren Schweregrad zu messen. Diese Bewertung kann relativ einfach durchgeführt werden , wenn Verhaltensaspekte in Drosophila, wie olfaktorische Lernen, negativ geotaxis oder schnelle Phototaxis zu messen, die 13-21 einen numerischen Leistungswert. Es ist auch möglich, die Wirkungen auf das neuronale Überleben durch Zählen Neuronen zu bestimmen. Dies ist jedoch nur möglich , wenn auf einer bestimmten Population konzentrieren , die eindeutig identifizierbar sind , wie die dopaminergen Neuronen, die bei Parkinson betroffen sind, und selbst dann waren die Ergebnisse umstritten 22-24. Das hier beschriebene Protokoll verwendet den Kragen Methode Paraffin Serienschnitte durchzuführen, ein Verfahrendas ursprünglich von Heisen und Böhl entwickelt, der es verwendet , um das Gehirn anatomisch Mutanten von Drosophila 25 isolieren. Die Verwendung des Kragens Methode wurde anschließend angepasst, in Kryoschnitten einschließlich Vibratom Abschnitte und Kunststoffprofile 26-28. Hier wird diese Methode Serienschnitte des gesamten Fliegenkopf zu erhalten , verwendet werden , die dann dazu verwendet werden kann , die Vakuolen zu messen , die 16,21,29-32 in Fliegen mit neurodegenerative Phänotypen zu entwickeln. Diese Messungen können in bestimmten Gehirnbereichen durchgeführt werden oder kann das gesamte Gehirn bedecken; der letztere Ansatz ermöglicht es, selbst schwache degenerative Phänotypen zu identifizieren, da während des Alterns beobachtet. Wenn schließlich der Kragen verwendet wird, kann bis zu 20 Fliegen wie einer Zubereitung verarbeitet werden, die nicht nur weniger zeitaufwendig, sondern ermöglicht auch die Analyse von Kontroll- und experimentellen Fliegen in der gleichen Zubereitung, Artefakte aufgrund von geringen Änderungen minimiert in die Vorbereitung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>TS 48-100</td>
			<td>We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber ice cube tray for embedding</td>
			<td>Household store</td>
			<td></td>
			<td>The size can be made to fit by glueing in additional walls&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizing dish</td>
			<td>Fisher Scientific company</td>
			<td>08-762-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ether</td>
			<td>Fisher Scientific Company</td>
			<td>E138-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choloroform</td>
			<td>Fisher Scientific Company</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific Company</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylbenzoate</td>
			<td>Fisher Scientific Company</td>
			<td>M205-500</td>
			<td>Distinct Odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use in fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific Company</td>
			<td>T565</td>
			<td>Make sure to keep extra melted in a 65&#176;C waterbath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Reichert Jung 2040 Autocut</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Fisher Scientific Company</td>
			<td>12-550D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific Company</td>
			<td>12-545-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeClear</td>
			<td>Fisher Scientific Company</td>
			<td>314-629</td>
			<td>Three different containers for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Staining Jar with Cover</td>
			<td>Ted Pella Inc.&#160;</td>
			<td>432-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher Scientific Company</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P8290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass histology to quantify neurodegeneration in drosophila

Progressive neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit (AD) oder Parkinson-Krankheit (PD) sind weltweit eine zunehmende Bedrohung für die menschliche Gesundheit. Obwohl Säugetiermodelle wichtige Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathogenität zur Verfügung gestellt haben, begrenzen die Komplexität von Säugetiersystemen zusammen mit ihren hohen Kosten ihre Verwendung. Daher stellt die einfache , aber gut etablierte Drosophila - Modell-System eine Alternative für die molekularen Mechanismen zu untersuchen , die bei diesen Erkrankungen betroffen sind. Neben Verhaltensdefizite sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch histologische Phänotypen wie neuronaler Tod und Axonopathie charakterisiert. Um neuronale Degeneration zu quantifizieren und zu bestimmen, wie sie durch genetische und Umweltfaktoren beeinflusst wird, verwenden wir einen histologischen Ansatz, der auf die Messung der Vakuolen in erwachsenen Fliege Gehirn basiert. Um die Auswirkungen der systematischen Fehler minimieren und direkt vergleichen Abschnitte von Steuerung und experimental Fliegen in einem Präparat, verwenden wir den &#39;Kragen&#39; Methode für Paraffinschnitten. Neurodegeneration wird dann durch Messen der Größe und / oder Anzahl der Vakuolen beurteilt, die in der Flug Gehirn entwickelt haben. Dies kann entweder durch die Konzentration auf eine bestimmte Region von Interesse durchgeführt werden oder durch das gesamte Gehirn Analyse von Serienschnitten zu erhalten, die den gesamten Kopf erstrecken. Daher ermöglicht dieses Verfahren nicht nur eine schwere Degeneration zu messen, sondern auch relativ mild Phänotypen, die nur nachweisbar in einigen Abschnitten sind, wie während der normalen Alterung auftritt.

Mit Hilfe der beschriebenen Methode führt in Serienschnitten durch das Auge Pigment gefärbt 33, die das gesamte Fliegenkopf umfassen. Ein Teil davon ist in 1B gezeigt, wobei die Abschnitte von einem einzelnen Kopf von oben nach unten dargestellt. Die Abschnitte aus verschiedenen Fliegen werden in diesem Beispiel nach rechts gesehen links. Zur Orientierung und Identifizierung der Fliegen zu erleichtern, ein eyeless fly (sine oculis) als Marker an Pos...

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Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila ist weithin als ein Modellsystem verwendet , Neurodegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, mit dem Degeneration, wie durch Vakuolenbildung im Gehirn bestimmt wird, kann quantifiziert werden. Es minimiert auch die Auswirkungen aufgrund der Versuchsdurchführung durch die Verarbeitung und sectioning Kontroll- und Versuchs Fliegen wie eine Probe.

Massen Histologie zu Quantifizieren Neurodegenerative Erkrankungen in<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

mass-histology-to-quantify-neurodegeneration-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

10.1K Aufrufe.  Oregon Health & Sciences University.  Drosophila ist weithin als ein Modellsystem verwendet , Neurodegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, mit dem Degeneration, wie durch Vakuolenbildung im Gehirn bestimmt wird, kann quantifiziert werden. Es minimiert auch die Auswirkungen aufgrund der Versuchsdurchführung durch die Verarbeitung und sectioning Kontroll- und Versuchs Fliegen wie eine Probe. 

Serie: Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become imperative to develop objective approaches to quantify changes in synaptic connectivity. Starting from sample fixation, this protocol details how to quantify synapse number both in dissociated neuronal culture and in brain sections using immunocytochemistry. Using compartment-specific antibodies, we label presynaptic terminals as well as sites of postsynaptic specialization. We define synapses as points of colocalization between the signals generated by these markers. The number of these colocalizations is quantified using a plug in Puncta Analyzer (written by Bary Wark, available upon request, c.eroglu@cellbio.duke.edu) under the ImageJ analysis software platform. The synapse assay described in this protocol can be applied to any neural tissue or culture preparation for which you have selective pre- and postsynaptic markers. This synapse assay is a valuable tool that can be widely utilized in the study of synaptic development.

This protocol details how to quantify synapse number both in dissociated neuronal culture and in brain sections using immunocytochemistry. Using compartment-specific antibodies, we label presynaptic terminals as well as sites of postsynaptic specialization. We define synapses as points of colocalization between the signals generated by these markers.

Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

Forschung

Neurowissenschaften

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying Bewegungsapparat, Lernen und Gedächtnis Defizite in Drosophila Modelle von Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.

The overall goal of this protocol is to accurately align magnetic resonance imaging (MRI) image volumes with histology sections via the creation of customized 3D-printed brain holders and slicer boxes.

3D-Drucktechnologie Verwendung MRI mit Histologie fusionieren: Ein Protokoll für Hirn Sectioning

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic Brain Injury (mTBI). The mechanisms responsible for its complex pathological changes remain largely elusive, despite a recent consensus to define the neuropathological criteria. Here, we describe a novel method to develop a model of CTE in Drosophila melanogaster&#160;(Drosophila&#160;)&#160;in an attempt to identify the key genes and pathways that lead to the characteristic hyperphosphorylated tau accumulation and neuronal death in the brain. Adjustable-strength impacts to inflict mild closed injury are delivered directly to the fly head, subjecting the head to rapid acceleration and deceleration. Our method eliminates the potential problems inherent with other Drosophila mTBI models (e.g.,animal death might be induced by damage to other parts of the body or to internal organs). The less labor- and cost-intensive animal care, short life span, and extensive genetic tools make the fruit fly ideal to study CTE pathogenesis and make it possible to perform large-scale, genome-wide forward genetic and pharmacological screens. We anticipate that the ongoing characterization of the model will generate important mechanistic insights on disease prevention and therapeutic approaches.

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

Here, we describe a new approach to inflict closed-head traumatic brain injury in Drosophila melanogaster. Our method has the advantage of directly delivering repetitive impacts with adjustable strength to the head alone. Further exploration of the invertebrate system will help to illuminate the pathogenesis of chronic traumatic encephalopathy.

Eine neuartige Methode zur Modellierung chronisch traumatischer Enzephalopathie in<em&gt; Drosophila</em

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...