Diese Methode bietet ein Werkzeug für Wissenschaftler, um umweltgenetische Faktoren zu untersuchen, die die Spermienmigration und das Verhalten in ihrer einheimischen Umgebung innerhalb des weiblichen Fortpflanzungstraktes beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik ergibt sich aus der transparenten Epidermis der C.elegans, die es Experimentatoren ermöglicht, Spermienbewegungen bei lebenden Tieren leicht zu visualisieren und aufzuzeichnen. Verwenden Sie zunächst einen Wurmpick aus einer Pasteur-Pipette und Platindraht, der an einem Ende abgeflacht ist, um 20 bis 30 L4-Bühnenhermaphrodite zu pflücken und vorsichtig auf eine sechs Zentimeter große NGM-Platte zu legen.
Inkubieren Sie die Hermaphrodite bei 20 Grad Celsius für 28 bis 30 Stunden. Als nächstes machen Sie eine männliche Färbeplatte. Verwenden Sie das Ende einer Glasrührstange, um E.coli vom Bakterienrasen einer gesäten Platte zu kratzen, und legen Sie es auf die Mitte einer ungesättigten NGM-Platte ab, wodurch ein Lebensmittelpunkt mit einem Durchmesser von fünf bis sieben Millimetern erreicht wird.
Mischen Sie zwei Mikroliter einmillimolarer Mito-Farbstoff in DMSO und 10 Mikroliter M9-Puffer in einem Mikrozentrifugenrohr. Pipette alle der Mito-Farbstoff-Lösung auf den Lebensmittelpunkt auf der männlichen Färbeplatte. Legen Sie die Platte in der Dunkelheit für 30 Minuten trocknen.
Unter dem Mikroskop, auf einer Platte mit ein- bis drei Tage alten erwachsenen C.elegans, identifizieren die Männchen durch ihren fächerförmigen Schwanz. Wählen Sie etwa 100 Männchen auf den mito-dye-befleckten Lebensmittelpunkt auf der männlichen Färbeplatte. Die Platte in Aluminiumfolie wickeln und über Nacht bei 16 Grad Celsius bebrüten.
Übertragen Sie die gefärbten Männchen am zweiten Tag auf eine neue nGM-Platte, um überschüssige Mito-Farbstoff-gefärbte Bakterien zu reinigen. Halten Sie die Platte im Dunkeln, bis sie sich paart. Um eine Paarungsplatte zu machen, tropfen Sie auf einer nicht gesäten NGM-Platte zwei Mikroliter dicker E.coli-Mischung.
Warten Sie etwa 10 bis 15 Minuten, bis die dicken Bakterien trocknen, um einen Paarungspunkt zu bilden. Während Sie darauf warten, dass die Steckplatte trocknet, mischen Sie 300 Mikroliter mit 1% Volumengewicht Tricain, 300 Mikroliter mit 0,1% Volumentetramisohle und 900 Mikroliter M9. 600 Mikroliter der Tetramisole/Tricain-Lösung in ein Uhrenglas geben. Übertragen Sie 12 bis 15 Hermaphrodite, die am ersten Tag gepflückt wurden, in die Tetramisole/Tricain-Lösung auf dem Uhrenglas.
Legen Sie die untere Hälfte einer Petrischale über das Uhrenglas, um es vor Verdunstung bedeckt zu halten, und brüten Sie 30 Minuten lang, um die Hermaphrodite zu immobilisieren. Als nächstes holen Sie die gesäte NGM-Platte, die die gefärbten Männchen enthält, aus der Dunkelheit und pflücken Sie 50 bis 60 gebeizte Männchen auf den getrockneten Paarungspunkt auf der Paarungsplatte. Bewahren Sie die Platte im Dunkeln auf.
Nachdem die Hermaphroditen immobilisiert sind, verwenden Sie eine gläserne Pasteur Pipette, um die immobilisierten Hermaphroditen aus dem Uhrenglas aufzunehmen. Vermeiden Sie es, die Hermaphrodite über den schmalen Teil der Pipette zu saugen. Übertragen Sie die Hermaphrodite auf eine nicht gesäte NGM-Platte.
Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich, und lassen Sie die überschüssige Flüssigkeit trocknen. Sobald alle sichtbaren Flüssigkeiten verdampft sind, übertragen Sie die anästhesierten Hermaphroditen auf den Paarungspunkt mit den gefärbten Männchen. Inkubieren Sie im Dunkeln für 30 Minuten, um die Paarung zu ermöglichen.
Wenn eine Spermienverteilungsbewertung gewünscht wird, übertragen Sie die gepaarten Hermaphrodite auf eine gesäte NGM-Platte und lassen Sie sie für eine Stunde ruhen, bevor sie zur Visualisierung montiert werden. Um Würmer zur Visualisierung zu montieren, tropfen Sie zunächst 10 bis 15 Mikroliter der Tetramisole/Tricain-Lösung auf das vorbereitete 2%Agarose-Pad und übertragen Sie die gepaarten Hermaphrodite in die Lösung auf dem Pad. Legen Sie einen Deckelschlupf über die Würmer.
Montieren Sie die Rutsche auf ein aufrechtes Mikroskop, das mit Epifluoreszenz ausgestattet ist, und positionieren Sie den Wurm so, dass sowohl die Vulva als auch eine Sperma zu sehen sind. Fokussieren Sie das Bild, indem Sie sich auf die Mitte der Spermatheca konzentrieren. Überprüfen Sie die Belichtung für DIC- und TRITC-Kanäle.
In DIC sind interne Wurmstrukturen deutlich sichtbar. In TRITC sind einzelne Spermien als ausgeprägte Punktias sichtbar. Erfassen Sie DIC- und Fluoreszenzbilder für jede Gebärmutter.
Um Zeitraffervideos zu erfassen, lokalisieren Sie zuerst die Hermaphrodite, die beschriftete Spermien in der Gebärmutter enthalten. Passen Sie auf dem Erfassungsfenster die Bildaufnahmeintervalle auf 15 bis 30 Sekunden und die Dauer auf 10 bis 20 Minuten pro Gebärmutter an. Klicken Sie dann auf Ausführen, um Zeitrafferbilder in DIC- und TRITC-Kanälen zu erfassen.
Beginnend mit der Vulva auf einem Ende und der Spermatheca auf der anderen Seite, teilen Sie die Gebärmutter in drei Zonen, mit Zone mit der Vulva und Zone drei enthält die Spermatheca. Zählen Sie manuell die Anzahl der Spermien in jedem Drittel der Gebärmutter, und melden Sie die Zahl in jeder Zone als Prozent der gesamten Spermien in der gesamten Gebärmutter. Verwenden Sie ggf. die Suchtabelle, um die Signalintensität der TRITC-Kanalbilder so einzustellen, dass jedes Sperma sichtbar und quantifiziert werden kann.
Um Spermien in Zeitrafferbildern zu verfolgen, verwenden Sie Fidschi-Software für die Analyse. Verwenden Sie die Funktion Bio-Formate Import, um die Bilder aus einer Zeitrafferserie als einen Hyperstack zu importieren. Klicken Sie dann auf Plugins, Tracking und dann auf Manuelle seimtheich.
Wählen Sie im geöffneten Dialogfeld das TrackMate-Werkzeug in der Fidschi-Symbolleiste aus. Doppelklicken Sie auf das Sperma, das verfolgt wird. Klicken Sie innerhalb des angezeigten grünen Kreises mit gestrichelten Linien, und ziehen Sie an die gewünschte Position.
Klicken Sie erneut auf den Kreis. Die gestrichelte grüne Linie verwandelt sich in eine durchgezogene grüne Linie. Drücken Sie gleichzeitig die Tasten Shift und L, um den Tracking-Modus zu aktivieren.
Wechseln Sie zum nächsten Frame in der Zeitrafferserie. Um die neue Position des verfolgten Spermas im neuen Frame festzulegen, bewegen Sie den Mauszeiger über den neuen Punkt, und drücken Sie die A-Taste. Der Tracker wird an der neuen Position angezeigt, und eine Linie wird angezeigt, die die Position verbindet, an der der Tracker im vorherigen Frame platziert wurde.
Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für den Rest der Frames. Nachdem die Ablaufverfolgungen abgeschlossen wurden, klicken Sie im Dialogfeld TrackMate auf Analysieren, um die benötigten Daten zu generieren. Um die Geschwindigkeit zu berechnen, dividieren Sie die gesamte Pfadlänge des Spermas durch die verstrichene Zeit.
Um die vektorielle Geschwindigkeit zu berechnen, zeichnen Sie eine Linie durch die Gebärmutter, beginnend mit der Vulva, die auf die Spermatheca zeigt. Verwenden Sie das Linienwerkzeug, um den Abstand zu messen, den das Sperma entlang dieser Linie vom Anfang bis zum Ende der Ablaufverfolgung migriert hat. Teilen Sie diese Entfernung durch die verstrichene Zeit.
Negative Werte deuten darauf hin, dass das Sperma von der Sperma entfernt ist. Um die Umkehrhäufigkeit aufzuzeichnen, zählen Sie die Anzahl der Male, in denen die Spermienspur während drei aufeinanderfolgenden Zeitrafferrahmen einen Winkel von weniger als 90 Grad erzeugt hat. In diesem Protokoll wurden nebel-2 q71 männliche Würmer mit Mito-Farbstoff befleckt und mit Wildtyp N2 Hermaphroditen gepaart.
Der erwachsene Hermaphrodit-Fortpflanzungstrakt hat zwei Arme, die Spiegelbilder voneinander sind. Bei der Paarung werden markierte Spermien in der Hermaphrodit-Gebärmutter durch die Vulva abgelagert. Die Spermien bewegen sich um die sich entwickelnden Embryonen in der Gebärmutter, in Richtung der Sperma, wo sie bis zur Befruchtung gespeichert werden.
Die Hermaphrodit-Gebärmutter wurde zur Quantifizierung der Spermienverteilung und -migration in drei Zonen unterteilt. Um die Spermiengeschwindigkeit und Umkehrhäufigkeit zu bewerten, wurden nur Spermien in Zone 2 durch Zeitrafferbilder verfolgt. Sperma in Zone eins, beginnend mit der Vulva, und Zone drei, einschließlich der Spermatheca, neigen dazu, sich in einem kreisförmigen Muster zu bewegen.
Sperma, das durch die roten und blauen Punkte gekennzeichnet war, hatte Spermiengeschwindigkeit und Umkehrhäufigkeit quantifiziert. Bei der Quantifizierung der Spermienverteilung in der Gebärmutter, richtige Spermien Führung mit Wild-Typ N2 Hermaphrodite und Nebel-2 q71 Männchen führte zu etwa 90% der markierten Spermien erreichen die Spermaatheca. Daten sollten nicht gezählt werden, wenn die Paarung zu wenig Spermien in der Gebärmutter oder zu viele Spermien in der Gebärmutter führt, die jede Spalte füllen.
Es ist wichtig, dass die Tiere bei jedem Transferschritt schonend behandelt werden, dass die Hermaphrodite vollständig immobilisiert sind und dass die Platten und Würmer, die den Myofarbstoff enthalten, vor Licht abgeschirmt sind. Diese Methode kann mit Genknockdown- oder Knockout-Experimenten, Umwelt- oder chemischen Expositionsexperimenten oder anderen Manipulationen kombiniert werden, um Faktoren zu identifizieren, die die Spermienmigration regulieren können. Diese Technik hat es uns ermöglicht, spezifische Prostaglandine zu identifizieren, die wichtig sind, um das Sperma zur Eizelle zu führen.
Diese Prostaglandine werden über einen unkonventionellen Mechanismus synthetisiert, der bei höheren Säugetieren konserviert werden kann. Tetramisole, Tricain, DMSO sind Haut- und Augenreizstoffe und können bei hohen Dosen toxische Wirkungen haben. Es ist wichtig, die entsprechende Schutzausrüstung beim Umgang mit Chemikalien zu tragen.
