Dieses Protokoll zur Bestimmung der Brutgröße und der Lebensfähigkeit des Embryos wird von vielen C.elegans-Laboren verwendet. Eine Abnahme der Rohlingsgröße und der Lebensfähigkeit des Embryos kann auf Defekte in wichtigen Entwicklungsprozessen wie Myose, Befruchtung und Embryogenese hinweisen. Diese Technik bietet klare Anweisungen für unerfahrene C.elegans-Forscher.
Es ist relativ einfach einzurichten und auszuführen und ist ein guter Ausgangspunkt für die Arbeit mit neuen mutierten Stämmen. Die größte Herausforderung bei dieser Technik ist die Identifizierung von Embryonen und unbefruchteten Embryonen. Neue Forscher sollten die Identifizierung von Embryonen, Eizellen und den verschiedenen Larvenstadien üben, bevor sie mit diesen Experimenten beginnen.
Beschriften Sie zunächst die Rückseite der Platte und übertragen Sie einen einzelnen Hermaphroditen im L4-Stadium auf die Platte. Stellen Sie sicher, dass keine Embryonen oder andere Würmer auf die Platte übertragen werden. Lassen Sie die Würmer sich zu erwachsenen Tieren entwickeln und legen Sie sich 24 Stunden lang bei der Standard-Kulturtemperatur von 20 Grad Celsius selbst nach.
Erzielen Sie den Teller am dritten Tag. Beschriften Sie am nächsten Tag einen Satz neuer Platten und übertragen Sie den einzelnen Wurm des ersten Tages auf die neue Platte. Lassen Sie die Würmer 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius Embryonen legen.
Erzielen Sie den Teller am vierten Tag. Beschriften Sie am dritten Tag einen Satz neuer Platten und übertragen Sie die einzelnen Würmer des zweiten Tages auf die neue Platte. Lassen Sie die Würmer 24 Stunden lang bei 20 Grad Nachkommen legen.
Erzielen Sie den Teller am fünften Tag. Zeichnen Sie mit einem feinen Filzstift ein Rastermuster auf einen 35 Millimeter großen Deckel. Legen Sie den Gitterdeckel zum Zählen unter die Testplatte, um den Überblick über zuvor gezählte Würmer zu behalten.
Zählen Sie mit einem Differentialzellzähler die lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen innerhalb des einzelnen Quadrats. Bei Würmern an den quadratischen Rändern wird nach der Position des Wurmkopfes gezählt. Zähle Würmer mit Köpfen, die den oberen und linken Rand des Quadrats berühren.
Halten Sie die Anzahl der lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen in einem Laborbuch fest. Bewerten Sie am vierten Tag die Platte des zweiten Tages, indem Sie die lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen zählen und in einem Laborbuch festhalten. Bewerten Sie am fünften Tag die Platte des dritten Tages, indem Sie die lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen zählen und in einem Laborbuch festhalten.
Nachdem Sie die Rückseite der Platte beschriftet haben, übertragen Sie einen einzelnen L4-Hermaphroditwurm auf die Platte. Stellen Sie sicher, dass keine Embryonen oder andere Würmer auf die Platte übertragen werden. Übertragen Sie einen einzelnen männlichen L4-Wurm auf die Platte, auf der sich ein L-Vier-Hermaphrodit befindet.
Lassen Sie die Würmer 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius paaren und Nachkommen legen. Ritzen Sie die Platte für lebende Larven im Vergleich zu ungeschlüpften Embryonen am dritten Tag. Beschriften Sie am nächsten Tag einen Satz neuer Platten und übertragen Sie den Hermaphroditen und das Männchen auf die neue Platte.
Stellen Sie sicher, dass der Hermaphrodit das Erwachsenenalter erreicht hat. Lassen Sie die Hermaphroditen ihre Nachkommen 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius legen. Ritzen Sie die Platte für lebende Larven im Vergleich zu ungeschlüpften Embryonen am vierten Tag.
Beschriften Sie am dritten Tag einen Satz neuer Platten und übertragen Sie den Hermaphroditen und das Männchen auf die neue Platte. Lassen Sie die Würmer 24 Stunden lang bei 20 Grad Nachkommen legen. Bewerten Sie die Platte für lebende und nicht geschlüpfte Embryonen am fünften Tag.
Zählen Sie mit einem Differentialzellzähler die lebenden Larven und ungeschlüpften Embryonen vom ersten Tag an und halten Sie sie in einem Laborbuch fest. Zählen Sie am vierten Tag die lebenden Nachkommen und die ungeschlüpften Embryonen des zweiten Tages und halten Sie sie in einem Laborbuch fest. Überprüfen Sie den Teller des ersten Tages für Männer.
Wenn eine Paarung stattgefunden hat, beträgt das erwartete genetische Verhältnis von Hermaphroditen zu Männchen 50 zu 50. Wenn die Platte des ersten Tages keine Männchen enthält, kam es nicht zu einer Paarung zwischen dem Männchen und dem Hermaphroditen. Verwerfen Sie dieses Paarungspaar und halten Sie die Beobachtung im Laborbuch fest.
Zählen Sie am fünften Tag die lebenden Larven und die ungeschlüpften Embryonen des dritten Tages und halten Sie sie in einem Laborbuch fest. Der embryonale Viabilitätstest für N2 ergab einen Viabilitätsprozentsatz von 98,9%, während sowohl him-5(e1490) als auch spo-11(ok79) eine Verringerung der embryonalen Viabilität mit einem Prozentsatz von 74,9% bzw. 0,8% zeigten. Die durchschnittliche Brutgröße von N2, him-5(e1490) und spo-11(ok79) wurde mit 217, 105 bzw. 219 bestimmt.
Die Erkennung der verschiedenen Entwicklungsstadien von C. elegans ist wichtig für genaue und reproduzierbare Daten. Wir empfehlen, sich anhand von Bildern und einem Präpariermikroskop mit der Entwicklung von Würmern vertraut zu machen. Dieses Verfahren ist ein guter erster Schritt, um festzustellen, ob ein Gen an einem Entwicklungsprozess beteiligt ist, und kann von zytologischen Analysen gefolgt werden, um festzustellen, welcher Prozess gestört ist.
