Diese Methode zur Dissektion und Immunfluoreszenz wird von vielen C.elegans-Laboren verwendet. Es kann verwendet werden, um jedes Protein nachzuweisen, für das ein Antikörper oder markiertes Fusionsprotein verfügbar ist. Obwohl es etwas Übung erfordert, um diese Dissektion richtig zu machen, ist dieses Protokoll flexibel und unkompliziert zu beheben.
Für uns funktioniert die DAPI-Färbung immer und wir können normalerweise einen Zustand finden, der für jeden Antikörper funktioniert. Die größte Herausforderung für diese Technik ist der Präparierschritt. Sie müssen schnell, aber sicher arbeiten, um gute Keimbahnextrusionen zu erhalten.
Übung ist der Schlüssel. Legen Sie zunächst einen Halteobjektträger auf den Tisch eines Seziermikroskops und legen Sie das Deckglas auf den Halteobjektträger. Dann pipetten Sie vier Mikroliter der Sezierlösung in die Mitte des Deckglases und bewegen Sie den Halteschieber auf eine Seite der Bühne, um die Sicht freizugeben.
Nehmen Sie 10 bis 20 Hermaphroditen von einer NGM-Platte in den Tropfen der Sezierlösung. Es ist am besten, ungefähr 10 pro Folie auszuwählen, aber nicht so viele, dass sie nicht innerhalb von fünf Minuten seziert werden können. Um die Tiere zu sezieren, kreuzen Sie die Spitzen der Nadeln, um eine X-Form zu erhalten, und verwenden Sie die Unterseite des X, um einen Erwachsenen an die Oberfläche des Deckglases zu heften.
Als nächstes positionieren Sie die X-Form direkt hinter dem Pharynx, etwa ein Fünftel der Körperlänge eines jungen Erwachsenen oder knapp unter dem klaren Teil des Kopfes. Enthaupten Sie dann das Tier mit einer Scherenbewegung und lösen Sie sich vollständig aus der Körperhöhle zusammen mit einer oder beiden Darmhälften. Um die Probe mit Formaldehyd zu fixieren, pipetten Sie vier Mikroliter der fixierten Lösung auf dem Deckglas, sehr nahe am Tropfen bei den Tieren, vermeiden Sie es, direkt in den Präparationstropfen zu pipettieren und die sezierten Schlachtkörper zu verdrängen.
Stecken Sie das Deckglas mit einem Finger an den Halteschieber. Mit der anderen Hand streichen Sie das Deckglas ein paar Mal vorsichtig, um die Tropfen zu mischen. Halten Sie einen positiv geladenen Objektträger von vorne nach unten, verwenden Sie ihn, um das Deckglas in der Mitte des Objektträgers aufzunehmen, indem Sie den Probentropfen vorsichtig berühren, und die Oberflächenspannung des Tropfens nimmt das Deckglas auf.
Stellen Sie den Schieber auf die Bank und fixieren Sie ihn für genau fünf Minuten bei Raumtemperatur. Beschriften Sie die Folie während dieser Zeit mit einem Bleistift. Um den Riss mit flüssigem Stickstoff einzufrieren, während Sie den markierten Rand des Objektträgers mit einer Pinzette halten, senken Sie ihn vorsichtig in flüssigen Stickstoff.
Lassen Sie den Objektträger so los, dass er sich mit der Deckglasseite nach oben an die Seite des Becherglases lehnt, und die Objektträger sind innerhalb von 10 Sekunden eingefroren. Wenn Sie Trockeneis zum Einfrieren verwenden, halten Sie nach dem Abkratzen des Frosts von der Oberfläche des Aluminiumblocks mit einem Rasiermesser die beschriftete Kante des Objektträgers fest und legen Sie sie auf die geräumte Oberfläche, wobei Sie etwas Druck nach unten ausüben, um vollen Kontakt mit dem Block zu gewährleisten. Das Einfrieren erfolgt innerhalb von 10 Sekunden, wenn die Probe unter dem Deckglas zu Eis wird.
Entfernen Sie den gefrorenen Objektträger, indem Sie den beschrifteten kurzen Rand des Objektträgers fest greifen, und stützen Sie eine lange Kante gegen die Bank. Fassen Sie mit der anderen Hand einen Rasierer fest und schieben Sie die Rasiererkante den Objektträger hinunter, um das Deckglas von der Probe wegzustreichen. Legen Sie den Objektträger sofort in ein Coplin-Glas mit 95% Ethanol und lassen Sie die Objektträger mindestens fünf Minuten in Ethanol.
Dann waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur in PBST, während Sie für jede Wäsche frisches PBST verwenden. Fluoreszenzbildgebungsergebnisse von Keimbahnkernen zeigten, dass DAPI stark an DNA bindet. Die Immunfluoreszenzfärbung war wirksam, wenn der Antikörper, der auf RAD-51 abzielt, ein Marker für Doppelstrangbrüche, als diskrete Herde in miotischen Kernen vorhanden war, die auf Chromosomen kolokalisiert waren, die durch DAPI markiert waren.
Die kle-2-heterozygoten Mutanten weisen geringfügige Defekte in der Chromosomenstruktur auf, wie eine leicht ungeordnete DAPI-Färbung und eine Zunahme der Doppelstrangbruchzahl zeigen, was sich in der höheren Anzahl von RAD-51-Herden widerspiegelt. Sowohl die Dissektions- als auch die Gefrierrissschritte können schwierig sein, daher ist es wichtig, schnell und reibungslos zu arbeiten. Wir empfehlen, diese Schritte zu üben, bevor Sie das gesamte Protokoll ausprobieren.
Zum Beispiel könnten Sie üben, in einem größeren Flüssigkeitsvolumen, wie 200 Mikroliter, zu sezieren und allmählich auf unser empfohlenes Volumen von vier Mikrolitern in einem Deckblatt zu arbeiten. Diese Technik kann für hochauflösende Bildgebung auf einem konfokalen oder strukturierten Beleuchtungsmikroskop verwendet werden, oder sie kann in Kombination mit DNA oder RNA-FISH, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, verwendet werden, um zu visualisieren, wie sich Proteine in Bezug auf bestimmte Sequenzen lokalisieren.
