Unser Protokoll bietet ein neuartiges Werkzeug zur Bewertung des angiogenetischen Potenzials tumorassoziierter Primärneutrophilen in vivo, ohne künstliche neutrophile Zelllinienmodelle verwenden zu müssen. Die direkte Hemmung der Nicotinamidphosphoribosyltransferase, kurz NAMPT, bei tumorassoziierten Neutrophilen mit ihrem anschließenden Adoptivtransfer in tumortragende Tiere ermöglicht die Manipulation von Neutrophilen ohne systemische toxische Nebenwirkungen. Wir zeigen das therapeutische Potenzial manipulierter antiangiogener tumorassoziierter Neutrophilen nach der Übertragung in tumortragende Wirte für die Untersuchung potenzieller neutrophiler Immuntherapien in verschiedenen Krebsmodellen.
Um ein allogenes Tumor-Maus-Modell einzurichten, rasieren Sie die Haut von 10 acht bis 12 Wochen alten weiblichen Interferon alpha und Beta-Rezeptor-Untereinheit 1 Knockout-Mäuse mit einem elektrischen Rasierer und desinfizieren Sie die Haut mit 70%Ethanol, dann dreimal 10 bis zu den sechs B16F10 Melanomzellen pro Milliliter PBS in eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 0,4 mal 19-Millimeter-Nadel laden und 100 Mikroliter der Suspension subkutan an einer hinteren Flanke in jede rasierte Tier. Bei Neutrophil-Adoptivübertragung die B16F10-Melanomzellen auf sechsmal 10 bis die sechste Zelle pro Milliliter Konzentration in PBS verdünnen und mit NAMPT-Hemmer FK866 behandelte Neutrophile auf sechsmal 10 bis fünf Milliliter PBS-Konzentration verdünnen. Mischen Sie dann unbehandelte oder inhibitorbehandelte Neutrophile mit den Melanomzellen bei einem Neutrophilen-Tumor-Verhältnis von 1:10 und injizieren subkutan 100 Mikroliter Zellen in bis zu fünf Mäuse pro Gruppe.
Legen Sie nach den Injektionen bis zu fünf injizierte weibliche Mäuse in einen einzigen Käfig und verwenden Sie Sättel, um die Tumorlänge, -breite und -tiefe jeden Tag 14 Tage lang zu messen. An Tag 14 nach der Injektion, desinfizieren Sie die Haut jedes injizierten Tieres mit 70% Ethanol und verwenden Sie Schere und Zange, um die Tumore in ein 50-Milliliter konisches Rohr mit komplettem Medium auf Eis zu ernten. Um die Tumoren für die histologische Analyse zu schneiden, tauchen Sie die Tumore in eine optimale Schnitttemperaturverbindung und frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein, um sie bei minus 80 Grad Celsius zu lagern.
Tauen Sie die Proben am Tag des Schnitts auf minus 20 Grad Celsius, bevor Sie ein Kryotome verwenden, um Fünf-Mikrometer-Abschnitte zu erhalten. Nach der Fixierung in der unspezifischen Bindung, färben Sie die Tumorgewebeabschnitte mit den primären Antikörpern von Interesse für eine Stunde bei 20 Grad Celsius, gefolgt von drei Wäbungen in PBS. Nach der letzten Wäsche die Zellen mit einem geeigneten fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörper in einem kernnächtigen Farbstoff wie DAPI eine Stunde bei 20 Grad Celsius vor Licht geschützt färben.
Trocknen Sie die Dias am Ende der Inkubation 20 Minuten bei 20 Grad Celsius, bevor Sie die Proben mit einem wasserfreien Montagemedium montieren, dann bedecken Sie jeden Schlitten mit einem Deckelschlupf und lassen Sie das Montagemedium eine Stunde bei 37 Grad Celsius trocknen, bevor sie die Gewebe mittels Fluoreszenzmikroskopie abbilden. Für die tumorassoziierte Neutrophilenisolierung legen Sie fünf Tumoren pro Brunnen in einzelne Brunnen einer sterilen Sechs-Brunnen-Platte, wie sie geerntet werden, und verwenden Sie sterile Scheren, um die Tumore in zwei bis drei Millimeter Stücke zu zerkleinern. Als nächstes verdauen Sie die Tumorfragmente mit einem Milliliter Dispase-Kollagenase d-Dnase 1-Lösung für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit und mischen die Proben alle 15 Minuten mit einer 10-Milliliter-Spritze.
Filtern Sie die Zellen am Ende der Inkubation durch 100-Mikrometer-Siebe in eine 15-Milliliter-Röhre pro Brunnen, um die unverdauten Fasern zu entfernen und PBS zu einem Endvolumen von 15 Millilitern hinzuzufügen. Sammeln Sie die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation und lyse die roten Blutkörperchen mit einem Milliliter Lysepuffer pro Tube. Nach dem Mischen den Inhalt aus jedem Rohr in einem einzigen 15-Milliliter-Rohr kombinieren und die Reaktion nach zwei Minuten mit 11 Millilitern komplettem Vier-Grad-Celsius-Medium stoppen.
Nach der Zentrifugation das Pellet in einem Milliliter PBS wieder aufhängen und jede unspezifische Bindung mit drei Mikrolitern Fc-Block-Antikörper n.A. 15 Minuten auf Eis blockieren. Am Ende der Inkubation die Zellen mit Anti-CD11b- und Ly6G-Antikörpern und allen anderen von Interesse entfernten Antikörpern sowie DAPI für eine 30-minütige Inkubation auf lichtgeschütztem Eis kennzeichnen. Am Ende der Inkubation Waschen Sie die Zellen in 14 Milliliter PBS und setzen Sie die Pellets mit einem Mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter frischer vollständiger mittlerer Konzentration auf Eis aus, und sortieren Sie dann die CD11b-positiven, Ly6G, hohen DAPI-negativen Neutrophilen auf einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer nach Standard-Sortierprotokollen, und überprüfen die Reinheit der isolierten Neutrophilen auf dem Durchflusszytometer am Ende der Art.
Zur in vitro tumorassoziierten Neutrophilenhemmung, Samen 1,5 mal 10 bis die fünfte sortierte Neutrophile in jedem von zwei Brunnen einer 96-well U-Bodenplatte und fügen FK866 zu einer Endkonzentration von 100 Nanomolar in vollständigem Medium in einem Brunnen und ein gleiches Volumen des vollständigen Mediums allein zum anderen Gut hinzu. Nach zwei Stunden im Zellkultur-Inkubator die Zellen zweimal mit PBS waschen und die Pellets in PBS in der entsprechenden Konzentration für die anschließende Injektion wieder aufsetzen. NAMPT-hemmerbehandelte Neutrophile haben eine signifikant verminderte Fähigkeit, die Aortenzweigbildung im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu stimulieren.
Darüber hinaus induziert die subkutane Injektion von inhibitorbehandelten antiangiogenen Neutrophilen eine signifikante Beeinträchtigung des Tumorwachstums im Vergleich zu Mäusen, die mit unbehandeltem Interferon alpha und Beta-Rezeptor-Untereinheit 1 Knockout-Neutrophilen injiziert werden. Die histologische Untersuchung der extrahierten Tumoren bestätigt ferner die signifikante Unterdrückung der Angiogenese bei Tumoren, die von Mäusen isoliert wurden, die mit mit Inhibitoren behandelten tumorassoziierten Neutrophilen im Vergleich zu solchen, die mit unbehandelten Knockout-Neutrophilen injiziert wurden. Um die Eigenschaften von FK866-behandelten tumorassoziierten Neutrophilen zu bewerten, können quantitative PCR und Western Blot durchgeführt werden, um die Aktivierung intrazellulärer Bahnen zu untersuchen, die an der neutrophilen Polarisation beteiligt sind.
Da Neutrophile kurzlebig sind, ist es notwendig, alle Schritte so schnell wie möglich durchzuführen und Neutrophile während des gesamten Eingriffs kalt zu halten. Diese Technik ebnet den Weg für die Untersuchung der intrazellulären Mechanismen und Faktoren, die an der Regulierung angiogener und tumoriogener Eigenschaften tumorassoziierter Neutrophilen in vivo beteiligt sind.
