Die Erzeugung primärer zellulärer Modelle oder organoidähnlicher Strukturen ist der Schlüssel zur Beantwortung vieler zeitgenössischer Fragen in der Biologie. Zum Beispiel interessieren wir uns seit geraumer Zeit für die Mechanismen, die von menschlichen Viren verwendet werden, um die Replikation in der Speicheldrüse zu erleichtern, da es ein wichtiger Ort für die horizontale Übertragung ist. Die Entwicklung des in diesem Protokoll beschriebenen Salisphärensystems ist ein entscheidender Fortschritt in unserem Bestreben, diese Art von Fragen zu beantworten.
Diese Technik ermöglicht es uns, Primärzellen aus einer Vielzahl von verschiedenen Patientenproben zu erzeugen. Die Zellmodelle erinnern eher an die In-vivo-Typsituation, da die Zellen nicht modelliert oder transformiert werden, wie viele Zelltypen, die häufig für In-vitro-Experimente verwendet werden. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um ähnliche Zellen aus der primären submandibulären Drüse der Maus zu generieren, und das Protokoll wäre wahrscheinlich für andere Organe mit ähnlichen zellulären Strukturen nützlich.
Innerhalb von zwei bis vier Stunden nach der Entfernung vom Patienten, auf einer Kulturplatte, verwenden Sie autoklavierte sterilisierte sezierte Schere und chirurgische Zange, um das Speicheldrüsengewebe in feine Stücke in der Größe von ein bis zwei Millimetern zu zerkleinern. Fügen Sie dem zerkleinerten Gewebe sechs Milliliter der Dispase/Collagenase-Lösung hinzu. Dann bei 37 Grad Celsius für ca. 30 Minuten bis eine Stunde inkubieren.
Stören Sie das Gewebe durch Pipettieren mit einer fünf Milliliter serologischen Pipette 15 bis 20 Mal. Bei 37 Grad Celsius für weitere 30 Minuten bis eine Stunde inkubieren. Wiederholen Sie den Pipetten- und Inkubationsschritt zwei bis drei weitere Male oder bis das Gewebe einer Gülle ähnelt und leicht durch die Pipettenöffnung gehen kann.
Um Brunnen mit BMM zu beschichten, langsam Pipette 500 Mikroliter von über Nacht aufgetaut BMM in jedem Brunnen einer sechs Brunnenplatte. Langsam wirbeln Sie die Platte, um das BMM gleichmäßig über die Brunnen zu verteilen. Dann inkubieren Sie die beschichteten Platten bei 37 Grad Celsius für mindestens 15 Minuten vor der Verwendung, damit das BMM verfestigen kann.
Übertragen Sie zunächst die Dispase/Collagenase-Lösung, die homogenisiertes Gewebe enthält, auf ein 15 Milliliter konisches Rohr. Waschen Sie die Wand der Platte einmal mit sechs Milliliter DPBS, um die verbleibenden Zellen in das konische Rohr zu übertragen. Dann filtern Sie durch ein 70 Mikrometer Nylon-Netzzellsieb das Homogenat in ein neues 50 Milliliter konisches Rohr, um unverdautes Gewebe zu entfernen.
Zentrifuge gespannte Zellen für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand. Dann setzen Sie das Zellpellet in 10 Milliliter 1X RBC Lyse Puffer wieder auf.
Fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie dann 20 bis 25 Milliliter DPBS hinzu, um den RBC-Lysepuffer zu neutralisieren und die Lyse von Speichelzellen zu minimieren. Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g.
Weißes Zellpellet zeigt vollständige Lyse aller RBC. Wenn das Pellet eine rote Farbe hat, wiederholen Sie die Behandlung mit dem RBC-Lysepuffer. Den Überstand ansaugen und das Pellet in ein bis zwei Milliliter BEGM wieder aufhängen und dann die resuspendierten Zellen auf BMM-beschichtete Brunnen übertragen.
Bei 37 Grad Celsius inkubieren. Einmal auf BMM plattiert, bilden sich Zellen über einen Zeitraum von zwei bis drei Tagen zu sphärischen Strukturen oder Salisphären. Zellen können als Salisphären für etwa fünf bis sieben Tage aufrechterhalten werden, bevor das BMM zu abbauen beginnt, so dass die Zellen auf den Kunststoff zugreifen und haften und als Monolayer wachsen.
Zuerst die Medien aus den Brunnen ansaugen und jedem Brunnen einen Milliliter Dispase/Collagenase-Lösung hinzufügen. Bei 37 Grad Celsius ca. 15 Minuten oder bis sich das BMM weitgehend aufgelöst hat, inkubieren. Dann übertragen Sie die Zellen in ein 15 Milliliter konisches Rohr und waschen Brunnen einmal mit ein bis drei Milliliter DPBS, um die verbleibenden Zellen zu erhalten.
Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in zwei Milliliter Trypsin wieder auf. Wieder bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren.
Als Nächstes fügen Sie dem Rohr alle vollständigen Medien hinzu, die 10% Serum enthalten, um das Trypsin zu neutralisieren. Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand, um Restmedien, Trypsin und Serum zu entfernen und dann die Zellen in DPBS wieder auszusetzen.
Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in BEGM wieder auf. Um das Pellet als Kugeln zu erhalten, die resuspendierten Zellen auf erstarrte BMM-beschichtete Kulturgerichte zu verfestigen.
Kultur alle Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für fünf bis sieben Tage vor der Subkultivierung gehalten. Füttern Sie alle zwei bis drei Tage mit frischem BEGM. Um die Zellen als Monolayer auf Kunststoffkulturgeschirr zu vermehren, die BEGM-Medien aus der Schale zu saugen und einmal mit DBPS zu waschen, um Restmedien zu entfernen.
Fügen Sie zwei Milliliter Trypsin hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten oder bis sich die Zellen vollständig gelöst haben. Neutralisieren Sie Trypsin mit vier Millilitern eines vollständigen Mediums, das 10% Serum enthält. Dann die Schale sanft kippen und Zellen auf ein 15 Milliliter konisches Rohr übertragen.
Waschen Sie die Platte einmal mit etwa fünf Milliliter DPBS, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand.
Um Restmedien zu entfernen, setzen Sie Zellen in sechs bis zehn Milliliter DPBS wieder aus. Zentrifuge für fünf Minuten bei 500 mal g. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie in BEGM.
Dann die Zellen auf die behandelten Kunststoff-Gewebekultur-Gerichte aufgeben. Kultur die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für fünf bis sieben Tage vor der Subkultivierung gehalten. Füttern Sie alle zwei bis drei Tage mit frischem BEGM.
In diesem Protokoll bildeten Zellen nach der Beschichtung von Zellen aus dem verdauten Gewebe zwei bis drei Tage lang leicht kleine Cluster, die sich weiterhin in der Größe von bis zu 15 bis 20 Zellen pro Cluster ausdehnten. Salisphärenzellen wurden auf zellkultivierten behandelten Kunststoff endiziert und als Monolayer angebaut, wo sie eine Morphologie aufweisen, die mit Zellen epitheliaalen Ursprungs übereinstimmt. Die richtige aseptische Technik und Sorgfalt ist notwendig, um bakterielle oder Pilzkontamination zu vermeiden.
Keine Menge an Antibiotika oder Antimykotika wird eine Kultur, die mit Mikroben schwärmen, retten. Wir beantworten Fragen zur viralen Pathogenese und -übertragung. Aber für andere, Dies bietet eine Möglichkeit, menschliche Speicheldrüsenzellen für eine beliebige Anzahl von Anwendungen wie Geweberegenerationstherapien zu studieren.
Für uns, die menschliche Cytomegalievirus zu studieren, hat diese Technik uns erlaubt, die molekularen Mechanismen zu erforschen, die das Virus nutzt, um zu infizieren und schließlich auf neue Wirte zu übertragen. Nichts, was in diesem Protokoll verwendet wird, ist von Natur aus gefährlich, aber Vorsicht ist immer geboten, wenn menschliches Gewebe und jede Art von chemischen Reagenzien behandelt werden.
